主要用途
逆轉錄PCR兩步法（RT-PCR）試劑是一種旨在通過逆轉錄酶（reverse
transcriptase）的作用把RNA逆轉錄成cDNA后，采用體外擴增DNA的方法（PCR法），進行分析RNA構造的權威而經典的技術方法。該技術經過精心研制、成功實驗證明的。其適用于RNA分析、cDNA克隆、RNA表達等。尤其可用于低拷貝量的RNA樣品。產品即到即用，性能穩定，嚴格無核酶污染，操作簡便，逆轉錄效率和擴增產量皆高，重復性好。
技術背景
單鏈DNA結合蛋白（Single-Stranded DNA Binding Protein；SSB）用于改善逆轉錄酶（reverse
transcriptase）的反應產物和作用效率。超能逆轉錄酶（Super reverse
transcriptase）是一種DNA聚合酶，用于合成以單鏈RNA為模板的配對性DNA，并能最大限度地增加第一條鏈的cDNA的產量。RNA核酸酶抑制劑（RNAsin）具有廣譜穩定的RNA酶抑制功能，用于高質量清除RNA酶污染。
產品內容
引導液（Reagent A） 90微升
逆轉液（Reagent B） 162微升
反應液（Reagent C） 600微升
補充液（Reagent D） 2毫升
產品說明書 1份
保存方式
保存在－20℃冰箱里，避免反復凍融；有效保證6月
用戶自備
RNA樣品：用于逆轉錄擴增的模板
PCR引物：用于逆轉錄的啟動DNA片段
干式恒溫儀：用于逆轉錄反應的孵育
0.5毫升PCR管：用于逆轉錄和PCR反應的容器
渦旋震蕩儀：用于反應物混勻
微型臺式離心機：用于樣品操作
PCR擴增儀：用于核酸產物擴增
實驗步驟
實驗開始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的引導液（Reagent A）、逆轉液（Reagent B）、反應液（Reagent C）和補充液（Reagent D），以及用戶自備的RNA樣品和引物置入冰槽里融化；同時將干式恒溫儀分別設置到70℃和37℃。然后進行下列操作。
第一步：cDNA合成
分別將融化的試劑盒里的試劑溶液渦旋震蕩2秒
放進微型臺式離心機瞬時離心5秒
移出4.5微升引導液（Reagent A）到新的0.5毫升PCR管
加入8微升用戶自備的RNA樣品（5微克總RNA或0.25微克POLY A+ RNA）
用槍頭混勻
放進70℃干式恒溫儀孵育3分鐘
即刻放進冰槽里
加入8微升逆轉液（Reagent B）
用槍頭混勻
放進微型臺式離心機瞬時離心5秒
放進37℃干式恒溫儀孵育60分鐘
即刻放進冰槽里
加入80微升補充液（Reagent D）稀釋，混勻
置入冰槽里備用或放進－20℃冰箱里保存
第二步：cDNA擴增
移出30微升反應液（Reagent C）到新的0.5毫升PCR管
加入用戶自備的引物F和R（分別總量為350納克）
加入2微升上述稀釋的cDNA合成物
最后加入補充液（Reagent D）到總量50微升，混勻
放進4℃微型臺式離心機瞬時離心5秒
使用1000微升槍頭加入2滴礦物油（注意：參見注意事項6）
放進PCR擴增儀，PCR反應程序為：
溫度（℃） | 時間 | 循環 |
95 | 2分鐘 | 1 |
95 Tm用戶設定溫度（50－62） 70 | 30秒 1分鐘 30秒 |
35 |
70 | 5分鐘 | 1 |
PCR產物置于－20℃冰箱里保存，直到進行任何后續實驗
進行瓊脂糖凝膠電泳分析
注意事項
本產品為20次操作
整個操作須在4℃狀態下進行
避免反復凍融
整個操作須戴手套，建議使用濾芯槍頭，并格外小心，防止降解RNA
建議所有的操作用品屬于RNA專用
建議使用5微克總RNA樣品量；為了確保獲得滿意效果，不要低于500納克
根據用戶PCR儀的性能，決定是否加入礦物油（Mineral Oil）
根據Tm=4（G+C）+2（A+T）公式確定Tm溫度；建議使用分析軟件
本公司提供系列RT－PCR產品