Cell Counting Kit-8（簡稱CCK8）試劑可用于簡便而準確的細胞增殖和毒性分析。相信做細胞的童鞋們對他都很熟悉，然鵝，你確定你使用CCK-8試劑的方式是完全正確的嗎？我們還是來仔細了解下吧：
一、CCK8檢測細胞增殖/毒性的原理
WST-8【化學名：2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑單鈉鹽】屬于MTT的升級產品，在電子耦合試劑存在的情況下，可以被線粒體內的脫氫酶還原生成高度水溶性的黃色甲瓚產物(Formazan dye)。生成的甲瓚物的顏色的深淺與活細胞的數量成正比，因此可利用這一特性直接進行細胞增殖和毒性分析，使用酶標儀在450mM波長處測定OD值，間接反映活細胞數量。
用途：藥物篩選、細胞增殖測定、細胞毒性測定、腫瘤藥敏試驗。
CCK-8的優點：
使用方便快捷，省去了洗滌細胞，不需要放射性同位素和有機溶劑；
CCK-8法的檢測靈敏度很高，甚至可以測定較低細胞密度；
CCK-8法的重復性優于MTT法；
CCK-8法對細胞毒性小；
CCK-8細胞活性檢測試劑中為1瓶溶液，毋需預制，即開即用。
CCK-8的缺點：
與MTT法相比，CCK-8和XTT的價格比較貴。
CCK-8試劑的顏色為淡紅色，與含酚紅的培養基顏色接近，不注意的話容易產生漏加或多加。
CCK-8與以往的增殖/毒性測定試劑相比較：
二、CCK8檢測細胞增殖/毒性的方法
實驗一：細胞增殖分析
1、制備細胞懸液：細胞計數
2、接種到96孔板中：根據合適的鋪板細胞數，每孔約100ul細胞懸液，同樣的樣本可做3個重復。
3、37℃培養箱中培養：細胞接種后貼壁大約需要培養2-4小時，如果不需要貼壁，這步可以省去。
4、加入10ul CCK8：由于每孔加入CCK8量比較少，有可能因試劑沾在孔壁上而帶來誤差，建議在加完試劑后輕輕敲擊培養板以幫助混勻。或者直接配置含10%CCK8的培養基，以換液的形式加入。
5、培養1-4小時:細胞種類不同，形成的Formazan的量也不一樣。如果顯色不夠的話，可以繼續培養，以確認最佳條件。特別是血液細胞形成的Formazan很少，需要較長的顯色時間（5-6小時）。
6、測定450nm吸光度：建議采用雙波長進行測定，檢測波長450-490nm，參比波長600-650nm。
實驗二：細胞毒性分析
1、制備細胞懸液：細胞計數
2、接種到96孔板中：根據合適的鋪板細胞數，每孔約100ul細胞懸液，同樣的樣本可做3個重復。
3、37℃培養箱中培養：細胞接種后貼壁大約需要培養2-4小時，如果不需要貼壁，這步可以省去。
4、加入不同濃度的毒性物質
5、37℃培養箱中培養：加入毒性物質的培養時間，要看毒性物質的性質和細胞的敏感性，一般要根據細胞周期來決定，起碼要一代以上的時間。
6、加入10ul CCK8：由于每孔加入CCK8量比較少，有可能因試劑沾在孔壁上而帶來誤差，建議在加完試劑后輕輕敲擊培養板以幫助混勻。
7、培養1-4小時:細胞種類不同，形成的Formazan的量也不一樣。如果顯色不夠的話，可以繼續培養，以確認最佳條件。特別是血液細胞形成的Formazan很少，需要較長的顯色時間（5-6小時）。
8、測定450nm吸光度：建議采用雙波長進行測定，檢測波長450-490nm，參比波長600-650nm。
注：
若暫時不測定OD值，可以向每孔中加入10 μL 0.1M的HCL溶液或者1% w/v SDS溶液，并遮蓋培養板避光保存在室溫條件下。24小時內測定，吸光度不會發生變化。
如果待測物質有氧化性或還原性的話，可在加CCK8之前更換新鮮培養基（除去培養基，并用培養基洗滌細胞兩次，然后加入新的培養基），去掉藥物影響。當然藥物影響比較小的情況下，可以不更換培養基，直接扣除培養基中加入藥物后的空白吸收即可。
三．CCK8檢測細胞增殖/毒性的注意事項和常見問題歸納
注意事項：
1.酚紅和血清對CCK8法的檢測不會造成干擾，可以通過扣除空白孔中本底的吸光度而消去。
2.CCK8可以檢測大腸桿菌，但不能檢測酵母細胞。在細胞增殖實驗每次測定的過程中需要避免細菌污染，以免影響結果。
3.當在培養箱內培養時，培養板最外一圈的孔最容易干燥揮發，由于體積不準確而增加誤差。一般情況下，最外一圈的孔只加培養基，不作為測定孔用。
4.在培養基中加入CCK8，培養一定的時間，測定450 nm的吸光度即為空白對照。在做加藥實驗時，還應考慮藥物的吸收，可在加入藥物的培養基中加入CCK8，培養一定的時間，測定450nm的吸光度作為空白對照。
5.金屬對CCK8顯色有影響：當終濃度為1 mM的氯化亞鉛、氯化鐵、硫酸銅會抑制5%、15%、90%的顯色反應，使靈敏度降級。如果終濃度是10 mM的話，將會100%抑制。
6.懸浮細胞由于染色比較困難，一般需要增加細胞數量和延長培養時間。
常見問題歸納：
1：CCK的保存和穩定性如何？
答：CCK穩定性高，避光條件-20℃有效期2年，4℃有效期1年。經常使用建議4℃保存，避免反復凍融。CCK正常顏色為粉紅色，若顏色發生明顯偏差，質量可能有發生變化。
2：CCK的細胞毒性如何？
答：CCK毒性非常低，因此CCK檢測完后相同的細胞還能用于其它細胞增殖檢測如結晶紫染色法，中性紅染色法或DNA熒光染色法。
3：CCK會對活細胞進行染色嗎？
答：不會，首先WST-8不會進入細胞染色，整個顯色反應都是在培養體系中進行的。另外WST和WST-8甲臜都屬于高度水溶性組分，反應結束更換新的培養液，即可清除外源組分。
4：做細胞活性檢測時，每孔應該接種多少個細胞？
答：當使用標準96孔板時，貼壁細胞的最小接種量至少為1,000個/孔(100 μL培養基)。檢測白細胞時的靈敏度相對較低，因此推薦接種量不低于2,500個/孔(100 μL培養基)。
5：在加入CCK-8時可否不更換培養基？
答：一般情況下可以不更換培養基。但是如果培養基里有氧化還原性物質的話，有可能會產生誤差，必須更換其它培養基。
6：若是使用6孔或者24孔板進行試驗，CCK試劑使用量怎么樣呢？
答：如果要使用6孔板或24孔板實驗，請先計算每孔相應的接種量，并按照每孔培養基總體積的10%加入CCK溶液。
7：能否用384孔板進行細胞增殖與活性檢測的實驗呢？
答：可以，CCK-8產品的使用量為每孔培養基總體積的10%。建議先將CCK-8產品稀釋一倍，然后加入培養基總體積的20%即可，這樣可減少誤差。
8：只可以在450 nm波長處測OD值嗎？
答：可以在450 nm波長處測OD值，但是若無此波長的濾光片，可選擇吸光度在430-490 nm之間的濾光片，但是450 nm濾光片的檢測靈敏度最高。
9：若是暫不檢測OD值，該如何處理？
答：若暫時不測定OD值，可以向每孔中加入10 μL 0.1 M的HCL溶液或者1% w/v SDS溶液，并遮蓋培養板避光保存在室溫條件下。24小時內測定，吸光度不會發生變化
10：在實驗中OD值太高，怎么解決？
答：可以縮短加入CCK-8后的培養時間。例如：可以把加入CCK-8試劑后的培養時間由2小時縮短為1小時。此外，可適當減少細胞的數量。
11：如果OD值太低，怎么解決？
答：可以采取2個辦法：1、適當增加細胞數量 2、延長加入CCK-8試劑后的反應時間。
12：應該每次做標準曲線嗎？
答：建議每次做。雖然細胞是一樣的，但是細胞的狀態不一定一樣。對于狀態不一樣的細胞，建議每次做標準曲線。