RPA（重組酶聚合酶擴增）技術原理及RPA與LAMP對比

英國TwistDx公司(前身為ASM科技有限公司)成立于1999年，基于英國劍橋Babraham研究院建立的生物技術公司。該公司通過突破等溫DNA擴增，開發的重組酶聚合酶擴增ZL技術(RPA),被譽為DNA診斷領域的革命性創新。(http://www.twistdx.co.uk)                  

What is RPA?

概念：重組酶聚合酶擴增(Recombinase Polymerase Amplification，RPA)，被稱為是可以替代PCR的核酸檢測技術。RPA技術主要依賴于三種酶：能結合單鏈核酸(寡核苷酸引物)的重組酶、單鏈DNA結合蛋白(SSB)和鏈置換DNA聚合酶。這三種酶的混合物在常溫下也有活性，最佳反應溫度在37°C左右。

RPA技術原理：

重組酶與引物結合形成的蛋白-DNA復合物，能在雙鏈DNA中尋找同源序列。一旦引物定位了同源序列，就會發生鏈交換反應形成并啟動DNA合成，對模板上的目標區域進行指數式擴增。被替換的DNA鏈與SSB結合，防止進一步替換。在這個體系中，由兩個相對的引物起始一個合成事件。整個過程進行得非常快，一般可在十分鐘之內獲得可檢出水平的擴增產物。

Who uses RPA?

以此為基礎的TwistAmp? 核酸擴增產品，能夠在15分鐘內進行常溫下的單分子核酸檢測該技術對硬件設備的要求很低，特別適合用于體外診斷、獸醫、食品安全、生物安全、農業等領域。

RPA技術有哪些特性:

RPA的特性：

快速檢測 15min進行單分子檢測試驗

簡易包裝 穩定凍干形式試劑

無需熱循環過程 擺脫任何儀器束縛

便攜 設備要求低，貧瘠條件亦能 完成檢測

RPA能實現多重化嗎

可以。RPA技術支持在同一個管中同時進行多個擴增反應。不過，多重化的引物組合需要精心設計，以便每個引物都能同樣有效的工作。需要注意的是，RPA反應的引物總量(nmol)最好不要超標太多。如果在一個反應中使用兩個以上的擴增引物，就應該控制不同引物的量。另外，我們應當事先考慮好檢測多個擴增事件的探針、設備以及熒光團的兼容性。

能否對模板進行定量

可以。擴增子達到可檢出水平的時間，依賴于反應起始時的模板量。初始模板的拷貝越多，擴增子就越快達到可檢出水平。不過，這種定量需要精心的實驗安排，確保對照反應是同時開始的。舉例來說，可以利用鎂離子的添加時間進行控制。因為鎂離子一旦進入體系，RPA反應就會開始。

此外，較慢的擴增過程有助于更精確的定量。我們可以通過調整反應條件或引物設計來減慢RPA的反應速度。

能否進行熒光終點分析

可以。這樣比較的是反應開始時的熒光和反應結束時的熒光，熒光增強意味著發生了擴增。

能否支持生物素或熒光標記的寡核苷酸

支持。在RPA反應中，連有生物素或熒光團的引物與未修飾的引物表現差不多。據悉還沒有發現任何差異。

跑膠前需要回收RPA產物嗎

需要。RPA反應中的物質會干擾瓊脂糖電泳，如果不進行產物回收，跑出來的帶會出現拖尾。

恒溫擴增技術

取代PCR的核酸擴增術

領域：廣泛應用于臨床診斷，食品安全檢測，動物疾病檢測等領域

特點：快速，高效，特異，無需專門設備

RPA與LAMP對比

LAMP:環介導等溫擴增法的特征是針對目標DNA鏈上的六個區段設計四個不同的引物然后再利用鏈置換反應在一定溫度下進行反應。反應只需要把基因模板、引物、鏈置換型DNA合成酶、基質等共同置于一定溫度下(60～65℃)、經一個步驟即可完成。

RPA：主要依賴于三種酶：能結合單鏈核酸(寡核苷酸引物)的重組酶、單鏈DNA結合蛋白(SSB)和鏈置換DNA聚合酶。

重組酶與引物結合形成的蛋白-DNA復合物，能在雙鏈DNA中尋找同源序列。一旦引物定位了同源序列，就會發生鏈交換反應形成并啟動DNA合成，對模板上的目標區域進行指數式擴增。被替換的DNA鏈與SSB結合，防止進一步替換。在這個體系中，由兩個相對的引物起始一個合成事件。