一、數據非依賴采集（DIA）
隨著生命科學的快速發展，蛋白質組學的關注焦點和研究趨勢已經逐漸從定性轉向定量。定量蛋白質組學是對細胞、組織乃至完整生物體的蛋白質表達量及差異進行分析，對于生物過程機理的探索和臨床診斷標志物的發現與驗證具有重要意義。
基于靜電場軌道阱 Orbitrap 的數據非依賴采集（Data Independent Acquisition, DIA）是賽默飛為用戶帶來的一項全新的、全息式的質譜技術。DIA 將質譜整個全掃描范圍分為若干個窗口，高速、循環地對每個窗口中的所有離子進行選擇、碎裂、檢測，從而無遺漏、無差異地獲得樣本中所有離子的全部碎片信息（圖 1）。
圖 1. DIA 與經典 Shotgun、SRM/MRM 的原理比較
與傳統蛋白質組學“鳥槍法”（Shotgun）相比，DIA：(1)
無歧視地獲得所有肽段的信息，不會造成低豐度蛋白信息的丟失，(2)循環時間固定，掃描點數均勻，定量準確度高，(3)
肽段的選擇沒有隨機性，數據可以回溯，對于復雜蛋白樣本，特別是低豐度蛋白具有更優異的重現性。與傳統質譜定量“金標準”選擇反應監測/
多反應監測（SRM/MRM）相比，DIA：(1) 無需提前指定目標肽段，適用于未知蛋白分析；(2)
無需優化方法，獲得數據后再基于譜圖庫實現定性確證和定量離子篩選；(3) 通量無上限，適合大規模蛋白定量分析。
形象地說，Shotgun 就像機槍掃射，高效率地打擊盡可能多的目標；SRM/MRM 就像精準狙擊，準確無誤地打擊特定目標；而DIA 就像地毯式轟炸，無遺漏地打擊全部目標（圖 2）。
圖 2. Shotgun、DIA 和 SRM/MRM 的特點比較
DIA 有效結合了 Shotgun 和 SRM/MRM
的優勢和特點，為用戶帶來全新的質譜分析體驗，和強大的蛋白質組學定量策略。在臨床研究中，高度的復雜性、龐大的樣本量、樣本的不穩定性是分析的難點，而
DIA
提供條件統一、無差別的質譜采集方法，能夠在樣本信息“完全未知”的情況下，對樣本進行高通量、高速度采集，獲得數據之后再進行深入解析和挖掘，是臨床蛋白質組學實驗的利器。在生物學研究中，多個時間點或多種條件下蛋白表達量的變化趨勢是分析的重點，而
DIA 的靈敏度、精確度和重現性為獲得準確、可靠的定量結果提供了有力保障。
1. DIA
DIA 通常將 m/z 400–1200 的全掃描范圍分割為 25 m/z 的窗口（共 32 個窗口），依次（m/z 400-425、m/z 425-450、……、m/z 1175-1200）將窗口內所有的離子選擇、碎裂，并檢測該窗口內離子產生的所有碎片，一次循環獲得 32 張二級譜圖，并不斷循環往復地進行采集（圖 3）。
圖 3. DIA 采集原理
Orbitrap 所具有的超高分辨率（_ 140,000）、超快掃描速度（32–64
ms）、超高靈敏度（amol 級），使 DIA 相比目前其他類似技術，如 SWATH 等，能夠為用戶帶來更出色的性能體驗。此外，Orbitrap
靈活多樣的采集方式，還能為用戶帶來更靈活的方法設置：(1)根據樣本的復雜程度使用更窄的選擇窗口（如 20 m/z
）或不對稱窗口（在出峰密集的范圍使用更窄的選擇窗口），實現更好的選擇性；(2)
根據肽段的信號強度調整離子注入時間及分辨率，達到更高的靈敏度；(3) 針對大規模樣本使用更快的掃描速度和更短的梯度，進一步提高分析效率；(4)
加入一級全掃描，采集碎片的同時獲得母離子信息，實現更準確的定性定量。
2. msxDIA
Orbitrap
超高分辨質譜除了為用戶帶來超高分辨率、超快掃描速度和超高靈敏度的分析性能外，先進的設計理念使其具有其他任何質譜都無法實現的功能——多重累積技術（Multiplexing,
msx）。將多重累積技術與 DIA 相結合，形成獨一無二的 msxDIA，進一步縮小 DIA 的選擇窗口，提高 DIA 的選擇性。
msxDIA 隨機將 5 個 4 m/z 窗口（或 2 個 10 m/z 窗口）依次選擇、碎片、并累積在一起，最后同時注入 Orbitrap 進行掃描，獲得5 個 4 m/z 窗口（或 2 個 10 m/z 窗口）中全部碎片信息的譜圖，再隨機選擇另外 5 個 4 m/z 窗口（或 2 個10 m/z 窗口）分析并依次進行下去，直至覆蓋整個全掃描范圍。msxDIA 總步長為 20 m/z ，不影響掃描速度，而這 20 m/z 由 5 段（或 2 段）獨立的窗口組成，客觀上使選擇窗口縮小到僅 4 m/z （或 10 m/z 窗口）。圖 4 以 2 x 10 m/z 模式為例，展示了 msxDIA 的原理。
圖 4. msxDIA 采集原理（2 x 10 m/z 模式）
msxDIA 采集得到的數據再利用 Skyline 軟件去多重累積（de-multiplexing），即可將每個碎片及響應強度歸屬到特定窗口，實現與 Shotgun、SRM/MRM 相當的選擇性，最大程度地減少共流出肽段和雜質的干擾（圖 5）。msxDIA 是 Orbitrap 獨一無二的全新掃描技術，其成果最先由 Skyline 的開發者、華盛頓大學 MacCoss 教授團隊提出，并發表在《Nature Method》雜志上（Nat. Methods, 2013, 10(8): 744-746）。
圖 5. msxDIA 去多重累積前后比較