肽段納流液相分離的出峰時間一般在30 s 以上,因此在合適的循環時間內,3 種DIA 方法可以根據樣本復雜程度靈活調節質量范圍、分辨率、選擇窗口等參數,達到最佳分析效果。例如,分析分子量較大的肽段時,質量范圍可以調整為m / z 400 ~1200 或更寬。
圖1 基于Q-qIT-OT 的3 種數據非依賴性采集原理。(A)經典數據非依賴性采集DIA;(B)寬窗口SIM 掃描
DIA (WiSIM-DIA);(C)全掃描DIA (Full MS-DIA)
Fig. 1 Schematic illustrating quadrupole-ion-orbitrap (Q-qIT-OT) based three data-independent acquisition (DIA) methods. (A) Classic DIA, (B) Wide isolation window SIM scan DIA (WiSIM-DIA), (C) Full scan DIA (Full MS-DIA)
3.2 復雜基質加標樣本的數據采集與分析
為了考察與比較3 種DIA 方法的分析效果,實驗對Hela 細胞全蛋白酶解液中添加的10 條低濃度肽段進行了數據采集。10 條合成的標準肽段均來自于非人源的植物蛋白,分子量在1100 ~1700 Da 之間,具有高度特異性。標準肽段溶液使用100 mg/ L Hela 細胞酶解液逐級稀釋為7 種濃度梯度,并逐一使用3 種DIA 方法采集(上樣量1 滋L),考察方法的選擇性、線性、重現性和靈敏度。圖2 展示了50 mg/ L 濃度肽段樣本的總離子流圖(TIC)、目標肽段YLGYLEQLLR (m / z 634. 356, 2+)的提取離子流圖(XIC)和子離子譜圖(MS/ MS)。由于Hela 細胞樣本高度復雜,標準肽段的色譜峰在TIC 中被完全掩蓋。另外,相比WiSIM-DIA 和Full MS-DIA,DIA 只有二級掃描沒有一級掃描,因此TIC 均由二級譜圖構成,信噪比相對較低。進一步提取該肽段的XIC 圖,其中DIA 基于子離子定量,選擇最強子離子m / z 991. 557 形成634. 356 ~991. 557 母子離子對提取色譜峰;WiSIM-DIA 和Full MS-DIA基于母離子定量,利用母離子精確質量數m / z 634. 356 提取色譜峰。通過比較XIC 可以看出,在復雜Hela 細胞基質中,3 種方法均能有效排除干擾。
圖2 3種數據非依賴性采集分析Hela 細胞樣本中的標準肽段。(A) DIA、(B) WiSIM-DIA 和(C) Full MS-DIA 的TIC 圖、肽段YLGYLEQLLR 離子對XIC 圖和MS/ MS 圖
Fig. 2Analysis of standard peptides spiked in Hela cell digest by the three DIA methods. TICs, peptide YLGYLEQLLR XICs and MS/ MS spectra of (A) classic DIA, (B) WiSIM-DIA and (C) Full MS-DIA data
肽段YLGYLEQLLR 的出峰時間約為35 s,3 種DIA 在出峰時間內掃描點數均達到10 以上,分別為22, 14, 14,具有良好的色譜峰型和可靠的定量峰面積。
MS/ MS 譜圖顯示了3 種選擇窗口下二級碎片離子的掃描結果。DIA 的選擇窗口最大(20 amu),質譜峰最多,但Orbitrap 高分辨掃描能夠有效區分碎片離子,因此譜圖具有良好的信噪比,可以有效用于定性與定量分析。WiSIM-DIA 窗口縮短為12 amu,但屬于線性離子阱低分辨掃描,因此質譜峰的區分能力相對較弱,造成一定干擾。Full MS-DIA 窗口僅3 amu,與DDA 相當,把基質干擾降到了最低,提供了良好的定性確證信息。
3.3 方法的線性、靈敏度的考察與比較
數據進一步使用Pinpoint 1. 4 軟件處理,考察方法在100 ng 復雜Hela 細胞基質下,20 ~200 pg 低濃度肽段范圍內的線性、重現性和靈敏度。并以10 條標準肽段的PRM 數據鑒定結果作為譜圖庫,進行譜圖匹配和定性確證。DIA 選取標準譜圖中強度最高的8 個子離子作為定性確證依據,并提取其中最好的2 個y 離子進行定量分析。WiSIM-DIA 和Full MS-DIA 同樣選取最強的8 個子離子進行定性確證,定量分析則使用一級母離子的單同位素峰和相鄰的第一個同位素峰。
以肽段YLGYLEQLLR ( m / z 634. 356, 2+) 為例, DIA 數據選取最強的y8 ( m / z 991. 557) 和y6 (m / z 771. 472)作為定量離子對,繪制標準曲線(圖3A)。曲線在100 fg ~ 50 pg 范圍內顯示出良好的線性,同時, 8 個定性確證離子與譜圖庫中的標準譜圖高度匹配,強度比例一致。WiSIM-DIA 選取單同位素峰M (m / z 634. 356)和相鄰同位素峰M+1 (m / z 634. 857)進行定量分析,在100 fg ~200 pg 范圍內具有良好的線性關系(圖3B)。WiSIM-DIA 二級為低分辨掃描,易受基質和共流出肽段碎片的干擾,但由于選擇窗口較小,因此也顯示出良好的子離子譜圖匹配結果。Full MS-DIA 定量流程與WiSIM-DIA完全一致,方法在500 fg ~200 pg 范圍內顯示出良好的線性關系,同時定性確證結果良好(圖3C)。
圖3 肽段YLGYLEQLLR 使用3 種數據非依賴性采集的定性定量結果。(A) DIA、(B) WiSIM-DIA 和(C) Full MS-DIA 的定量離子對XIC 圖、標準曲線和譜圖匹配確證圖。匹配確證柱狀圖從左到右依次為0. 5, 2, 10, 50 和200 mg/ L 和標準譜圖
Fig. 3 Confirmation and quantification of peptide YLGYLEQLLR using the three DIA methods. Quantification ion XICs, standard curves and spectra library matching charts of (A) classic DIA, (B) WiSIM-DIA and (C) Full MS-DIA data. The columns of spectra library matching charts represent 0. 5, 2, 10, 50 and 200 mg/ L and library spectrum from left to right, respectively