液相色譜耦聯Q Exactive 臺式軌道阱質譜儀分析利妥昔單克隆抗體
關鍵詞
單克隆抗體，完整蛋白質的質量測定，序列確定，蛋白質去卷積，自上而下的測序
目的
優化液相色譜質譜工作流程，采用整體柱在線耦聯Thermo Scientific Q Exactive 臺式軌道阱質譜儀對單克隆抗體進行分析和表征。
前言
單克隆抗體（mAb）是增長需求最快的醫藥產品之一。他們在多種病癥如癌癥、感染性疾病、過敏癥、炎癥和自免疫疾病的治療中發揮著主要作用。由于單克隆抗體可以表現出顯著的異質性，作為治療產品，新的mAb 要獲得批準需要進行大量的分析表征。質譜法已經成為表征單克隆抗體的重要工具，能測定完整蛋白及分離的輕鏈和重鏈的分子量、解析糖基化和糖鏈的結構，確證正確的氨基酸序列，鑒定雜質，如生產過程中固有的宿主細胞蛋白質（HCP）。
利妥昔單抗是一個拮抗蛋白質 CD20 的重組單克隆抗體，其在美國的商品名為 RituxanR（Biogen Idec 公司/ 基因泰克公司），在歐洲的商品名為 MabTheraR（羅氏）。它是第一代腫瘤免疫治療藥物之一。利妥昔單抗分別在1997 年被美國食品和藥物監督管理局和1998 年由歐盟委員會批準用于惡性淋巴瘤的治療。這個抗體的可變區域作用靶點為細胞表面分子 CD20，這些分子存在于一些非霍奇金淋巴瘤中。
在這個應用報告中，結合使用自上而下和自下而上的方法，不管是分析完整和還原的利妥昔單抗，還是對其進行氨基酸序列分析，Q Exactive Orbitrap 質譜儀都具有優異的表現。
此外，評價了兩套整體柱色譜系統在線耦合質譜儀的靈敏度。數據表明Q Exactive 系統具有優異的分辨率和質量準確度，是一個具有高置信度的篩選工具，可快速精確地進行生物制藥產品的開發和表征。
實驗部分
樣品制備
本研究所有實驗均采用商品化的單克隆抗體利妥昔。利妥昔是一種無菌，透明，無色，不含防腐劑的靜脈滴注用濃縮液。該產品濃度為 10 mg/mL，通常配制成7.35 mg/mL 的檸檬酸鈉緩沖注射液，其中含 0.7 mg/mL聚山梨醇酯 80、9.0 mg/mL 氯化鈉和無菌水，采用氫氧化鈉或鹽酸水溶液調 pH 值至 6.5。
由于利妥昔單抗中含聚山梨醇酯80，在進行 LC / MS 分析之前需對樣品進行透析。采用截留分子量為 3.5 kDa（MWCO）的Thermo ScientificTM Slide-A-LyzerTM 透析盒透析。在 4℃ 條件下，1 mL 利妥昔單抗在 2 L 20％ 乙腈水溶液中透析 48 h。
對利妥昔單抗的輕鏈和重鏈進行分析時，樣品與 5 mM 三羧甲基磷酸（TCEP）在 60℃ 條件下孵育 30 min，還原樣品中的二硫鍵。
為了對酶切后的 mAb 進行自下而上的分析，樣品還原后，繼續在室溫暗處與 20 mM 碘乙酰胺（IAA）進行烷基化反應 30 min。樣品采用 Thermo ScientificTM PierceTM C18 槍頭進行純化，采用 Thermo ScientificTM SpeedVaccTM 旋轉濃縮儀進行干燥，然后溶解在 0.5 M 三乙基碳酸氫銨緩沖液（TEAB ）中。在 0 h 和 1.5 h 先后兩次，按照 1:15（w/w）的比例加入測序級修飾胰蛋白酶（Promega），在 37 ℃ 條件下酶切 2.5 h。最后，加入適量三氟乙酸（TFA），調 pH 值至約為 3。
所有樣品放在含玻璃內插管的自動進樣器小瓶中（0.1 ml微量內插管，透明玻璃，VWR）。
液相色譜
實驗使用的色譜柱為按照文獻制備的 160×0.20 mm 內徑聚（苯乙烯- 二乙烯基苯）（PS-DVB）共聚物毛細管柱【1】和 Thermo ScientificTM PepSwiftTM 250×0.20 mm 內徑的 PS-DVB毛細管柱。蛋白質的分離使用 Thermo ScientificTM DionexTM UltiMateTM 3000 RSLCnano 系統，該系統配置 3 nL z- 型微量檢測池。分離過程中，柱溫：55℃，流速：1 μL/min，色譜梯度：乙腈（ACN）溶液（含 0.05% 三氟乙酸 TFA）的濃度從 20%升高至 60%，運行時間：10 min。對于胰蛋白酶的酶切混合物，色譜梯度：B 相濃度從 0% 升高至 50%，運行時間：30 min。對于還原型抗體，色譜梯度：B 相濃度從 35% 升高至 45%，運行時間：15 min。
采用 Thermo ScientificTM ProSwiftTM RP-10R 50 mm×1.0 mm 內徑的整體柱在更高流速分離蛋白質，使用的儀器為 Thermo ScientificTM DionexTM UltiMateTM 3000 RSLCnano 系統，該系統配置 45 nL 檢測池。分離過程中，柱溫設置為 55℃，流速為60 μL/min。色譜梯度：B 相濃度從 26% 升高至 80%，運行時間：20 min。對于還原型抗體，分離輕鏈和重鏈的色譜梯度：B 相濃度從 26% 升高至 56%，運行時間：20 min。
在上述梯度條件下，PepSwift 250 mm×0.2 mm 內徑的整體柱壓力在 190 bar 到 260 bar 之間，ProSwift RP-10R 50 mm×1 mm內徑的整體柱壓力在 120 bar 到 180 bar 之間。
在本研究的所有實驗中，流動相 A 是 0.05% 三氟乙酸水溶液，流動相 B 是 0.05% 三氟乙酸的乙腈溶液。色譜梯度見表 1 和表 2。
表 1. 本實驗所用的液相色譜梯度，
色譜柱： PepSwift 250 mm×0.2 mm 內徑，流速：1 μL/min
表2. 本實驗所用的液相色譜梯度，
色譜柱：ProSwift RP-10R 50 mm×1 mm 內徑，流速：60 μL/min
質譜
本研究所有實驗均采用 Q Exactive 臺式靜電場軌道阱質譜儀。采用 ProSwift RP-10R 50 mm x 1 mm 內徑色譜柱進行實驗時配合使用Thermo ScientificTM IonMaxTM 加熱電噴霧離子源，噴霧電壓為 4 KV，鞘氣和輔助氣流速分別為 15 和 5個單位。