1.5 方法 將水迷宮和跳臺篩選訓練合格的小鼠 80 只，雌雄各半，按體重隨機分為正常對照組、模型對照組、芎歸湯有效組分劑量 1 ～ 5 組及陽性藥組。芎歸湯有效組分劑量 1 ～ 5 組及陽性藥組分別給予各自治療藥物，按照 25ml/kg 體積每天灌胃，空白對照子給予相同體積生理鹽水，連續給藥 30 天。
1.5.1 Morris 水迷宮實驗 新購進的昆明種小鼠，穩定 3 天后，進行 Morris水迷宮篩選實驗 2 次。小鼠進行水迷宮篩選前先將小鼠放在平臺上 10 s，讓其認知平臺，然后將小鼠從平臺對角象限頭朝臂放入水中，觀察其 2 min 內能否找到平臺，能找到平臺的納入正式實驗，不能找到平臺的小鼠人為將其引導上平臺停留 10 s，10 min 后進行第二次篩選實驗，能找到的納入正式實驗，兩次都不能找到平臺的小鼠剔除出實驗。將篩選合格的小鼠進行水迷宮訓練實驗，每天4 次，上午下午各 2 次，訓練實驗同篩選實驗方法相同，如此連續訓練 10 ～ 15 次，確保每只小鼠都能在規定的時間內找到平臺。實驗時，平臺低于水面 1 cm，水溫 25.0 ± 1.0℃ ，水中加入漂白劑，充分混勻，使水呈乳白色，實驗期間迷宮外參照物保持不變。將小鼠分別由平臺對角象限頭朝桶臂放入水迷中，記錄小鼠在 2 min 內尋找平臺的時間( 潛伏期) 及經過平臺次數，作為學習記憶能力的指標，找到平臺后允許動物在平臺上停留30 s; 如果小鼠在 120 s 內未找到平臺，記為 120 s。測試過程中保持實驗室內燈光、物品等空間參照物擺放位置不變，排除干擾因素。
1.5.2 跳臺實驗 將水迷宮篩選訓練合格的小鼠分別放入跳臺不同的反應箱內適應 3 min，讓其認知環境，然后立即通以0.2mA電流，定時 5 min，將 5 min內能夠認知平臺并進行躲避電刺激的小鼠納入正式實驗。將不能認知平臺的小鼠人工引導其跳上平臺躲避電刺激，再次適應 3 min，進行第二次跳臺實驗篩選，將兩次都不能找到平臺并躲避電刺激的小鼠剔除出實驗。將篩選合格的小鼠進行跳臺訓練實驗，訓練方法同篩選方法，如此連續訓練 5 ～ 10 次。參照徐叔云經典的藥理實驗方法學中的跳臺實驗進行測試，分兩天進行，第一天學習，第二天記憶。實驗時，將小鼠放入反應箱內適應 3 min，然后立即通以0.2mA電流。動物受到電擊，正常的反應是跳回平臺以躲避傷害性刺激，多數動物可能再次或多次跳至銅柵上，受到電擊后又迅速跳回平臺。定時 5 min，分別記錄這兩天小鼠第一次跳下平臺的時間( 潛伏期) 以及 5 min 內小鼠跳下平臺受到電擊的次數( 錯誤次數) 。
1.5.3 Morris 水迷宮及跳臺實驗 第 31 天給藥后 30 min 除正常對照組外，腹腔注射東莨菪堿造模，給藥劑量為 2 mg/kg，注射體積為 3． 0 ml/kg。造模30 min 后進行 Morris 水迷宮實驗，觀察記錄各組小鼠在 2 min 之內的潛伏期及經過平臺次數。第 32 ～ 33 天進行跳臺學實驗，給藥方法及時間同上。其中第 32 天為跳臺學習實驗，第 33 天為跳臺記憶實驗，電流控制在0.2mA，定時5 min，分別記錄這兩天小鼠第一次跳下平臺的時間( 潛伏期) 以及 5 min 內小鼠跳下平臺受到電擊的次數( 錯誤次數) 。綜合分析其學習能力的差異性。
1.5.4 芎歸湯藥效 ED50計算 以東莨菪堿致癡呆模型 Morris水迷宮及跳臺實驗潛伏期為指標，按照藥效改善大于 25% 的動物，記為陽性，用 Bliss 計算法，確定芎歸湯的藥效 ED50。藥效改善率 =藥物組潛伏期 － 模型對照組潛伏期模型對照組潛伏期× 100%( 藥效改善率 ＞ 25% ，為有效，記為陽性)
3 討論
通過對各組小鼠 Morris 水迷宮及跳臺實驗的比較分析，芎歸湯各劑量組由高到低，學習記憶能力逐漸下降，呈現明顯的劑量依賴性，劑量 1 組藥理學效應最強。提示，芎歸湯對抗東莨菪堿致癡呆小鼠學習記憶能力衰退具有一定的保護作用，其效應大小隨著劑量的增高而增大，呈現明顯的" 量-效" 關系。與模型對照組比較，芎歸湯對東莨菪堿致癡呆小鼠 Morris 水迷宮實驗學習記憶能力減退的改善在 10.92 ～ 43.68 g/kg 劑量范圍內均有顯著性差異，且呈現一定的劑量依賴性，其 ED50為 4.79g / kg; 芎歸湯對東莨菪堿致癡呆小鼠跳臺學習記憶能力減退的改善在 2.73 ～ 43.68 g/kg 劑量范圍內均有顯著性差異，且呈現一定的劑量依賴性，其 ED50為 2.70g/kg。表明，芎歸湯在跳臺實驗中表現出的作用藥效果要優于在水迷宮中的表現。
目前關于 AD 的發病機制研究眾說紛紜，沒有一種假說可以完全解釋 AD 的發生發展。其中的膽堿能損傷假說是目前比較公認的主流學說之一，其認為乙酰膽堿是與學習和記憶相關的重要物質，而海馬是學習記憶的重要解剖基礎，發生 AD 時基底前腦區的膽堿能神經元丟失，造成乙酰膽堿的合成、儲存、釋放減少，從而導致以記憶和識別功能障礙為主的多種臨床表現。根據膽堿能假說研制的東莨菪堿致癡呆模型所造成的記憶障礙形式與老年性健忘癥非常相似，因而廣泛用于動物實驗中建立認知功能傷，用以驗證藥物的作用。而 Morris 水迷宮實驗和跳臺實驗又是研究學習記憶能力的最主要的實驗方法，因此，結合東莨菪堿致癡呆模型，應用 Morris 水迷宮和跳臺法對藥物進行藥效學研究就成為抗癡呆藥物的主流方法。但是，在實際實驗操作中筆者發現，Morris 水迷宮實驗和跳臺實驗均有其不足之處，如個體間的成績差異巨大，動物的回避性反應差異較大，需要檢測大量的動物等，因此在進行藥效學實驗室應綜合運用多種行為學檢測方法，綜合整理分析，進行藥效學評價，用以提高實驗結論的準確性和說服力，為更加有效、精確地進行相關藥物活性篩選和藥效評價提供實驗依據，從而加快中藥藥理學學科的發展和提高中藥新藥創制的水平。
因此，本次實驗以 Morris 水迷宮和跳法方法，對芎歸湯有效組分抗東莨菪堿致癡呆模型進行藥效學" 量-效" 關系綜合評價研究，分析芎歸湯不同劑量組的行為學數據，發現，對抗東莨菪堿致癡呆小鼠學習記憶能力衰退具有一定的改善作用，呈現明顯的劑量依賴。芎歸湯不同劑量組在跳臺實驗中的學習記憶能力衰退效果要優于在 Morris 水迷宮中的效果，跳臺藥效 ED50要小于水迷宮中的 ED50。
