轉基因食品的檢測（二）

(1) 定性PCR法

定性PCR可直接檢測啟動子、終止子、標記基因片斷、目的基因片斷。為使目的基因很好的進行表達，在構建基因表達載體時常在目的基因的5’和3’端分別加上啟動子和終止子。當前大約75%的轉基因植物中使用Ca MV( Cauliflower mosaicvirus) 3 5 S啟動子，其次是胭脂堿和章魚堿合成酶的NOS啟動子和Ocs啟動子。常用的終止子是胭脂堿合成酶的NOS終止子和Rubisco小亞基基因的3’端區域、所以當前對啟動子和終止子的檢測實際上是對Ca MV35S啟動子和NOS終止子的檢測。然而一些植物如十字花科植物易被CaMV感染而攜帶35S，故檢測出陽性信號;而NOS終止子來源于普遍存在的農桿菌(Agrobacterium tume faciens )，因此，用PCR對35S啟動子和NOS終止子進行檢測時應配合其他檢測。定性PCR受DNA抽提和純化的影響，如果DNA降解或受污染，檢測結果就會出現假陽性現象；只能初步確定是否為GMF但不能鑒定是哪種GMF。

(2) 定量PCR法

在實際貿易和食品消費中我們不僅想知道食品是否是轉基因的，而且還想知道其中外源基因的含量，即外源基因占GMF的百分含量。在普通的定性PCR擴增過程中，以不同濃度標準陽性樣品作參照，標準陽性物用基因工程方法合成，上游引用熒光標記，下游引物不標記，在模板擴增的同時，標準陽性物也被擴增。。最后根據吸光值作出吸光值與轉基因含量的標準曲線圖，以此可以確定檢測樣品的轉基因含量，這樣可以進行半定量檢測。

(3) 定量競爭性 QC一PCR法(Quantitative competitive PCR) 

在PCR的反應管中，同時放入用人工合成用熒光標記的模板和待測樣品讓兩者對同一引物同時擴增，反應完成后通過測定熒光強度推測待測樣品的DNA含量。

(4) 實時定量熒光PCR法〔11〕

實時定量熒光PCR技術是在常規PCR基礎上，添加一條熒光標記基因探針（一般為Taq man）。一個標記在探針的5'端，一個標記在探針的3'端，兩者構成能量傳遞結構，兩個熒光集團根據距離控制是吸收或抑制，在PCR不斷擴增中不斷檢測反應體系中熒光信號的變化，通過記錄循環次數和PCR體系中起始DNA量的對數值之間的線性關系確定起始DNA的量。用實時定量熒光PCR對轉基因食品進行檢測可避免普通PCR反應過程中由于外界污染或樣品本身DNA降解等原因造成的假陽性結果，但是實時定量熒光PCR儀價格昂貴，檢測費用高。

(5)反轉錄RT-PCR法

 反轉錄PCR克服了待檢樣品中外源基因含量特別微量，以mRNA為模板反轉錄成cDNA，再通過PCR擴增進行檢測。

(6) PCR—ELISA法

PCR一ELISA是I種將PCR高效性與ELISA高特異性結合在一起的轉基因檢測方法。利用共價交聯在PCR管壁上的寡核普酸作為固相引物，在Taq酶作用下，以目標核酸為模板進行擴增，產物一部分交聯在管壁上，為固相產物，一部分游離于液體中，為液相產物。對于固相產物，可用標記探針與之雜交，再用堿性磷酸酷酶標記的鏈親和素進行ELISA檢測，同時可通過凝膠電泳對液相產物進行分析。將PCR和ELISA兩種方法相結合，可以相互取長補短，使檢測的準確性大大提高。目前在我國尚未建立統一完備的轉基因食品的篩選方法，隨著轉基因食品的數量增多及我國加入世界貿易組織，在我國建立轉基因食品的篩選方法將對人群健康及生態環境的保護起積極的作用。

Southern雜交

Southern雜交技術在分子生物學中用于基因組DNA特定序列定位。在轉基因食品中用Southern技術，是要在知道該轉基因食品轉入外源基因片斷的情況下使用。以放射性或熒光標記的外源目的基因的同源序列作為探針與該食品原料農產品的總DNA進行雜交。首先用限制酶消化受體總DNA，通過瓊脂糖凝膠電泳按大小分離所得的片斷，隨后使DNA在原位發生變性，并從凝膠轉移至一固相支持體上。DNA轉移至固相支持體的過程中，各個DNA片斷的相對位置保持不變，用放射性或熒光標記的探針與各個DNA片斷雜交，經放射自顯影確定與探針互補的電泳條帶的位置。Southern技術用于食品外源基因的檢測可檢測出外源基因與內源基因有高度同源性的DNA片斷，且準確可靠，但對樣品的純度要求較高，費用也較高。

基因芯片

基因芯片〔12〕是20世紀80年代末在生命科學領域中迅速發展起來的一項高新技術，是由大量DNA或寡核苷酸探針密集排列的矩陣，基因芯片可以將目前通用的報告基因、抗性基因、啟動子和終止子的特異片段(靶片段)固定于玻片上制成檢測芯片，將從待檢樣品中提取的DNA擴增、標記后與芯片進行雜交，雜交信號由芯片掃描儀檢測，再經計算機軟件進行分析判斷,其基本原理為通過雜交檢測信號。基因芯片技術可對樣品進行集約化和平行處理。利用基因芯片可實現對DNA的準確、快速、大信息量的檢測。從而方便、快速地對大量待檢測轉基因作物進行靈敏、準確的檢測。        

其不足之處是每種檢測樣品首先必須有與之相配的非轉基因作物的芯片。

 2. 基因轉錄水平檢測

northern印跡雜交

將northern技術用于外源基因的測定可測定特定外源基因DNA的轉錄產物mRNA分子的大小和豐度。RNA分子在變性瓊脂糖凝膠中按其大小不同而相互分開，隨后將RNA轉移至活化纖維素、硝酸纖維素濾膜上。用放射性標記的外源DNA探針或RNA探針進行雜交和放射自顯影，確定外源DNA的轉錄產物RNA。

3. 基因翻譯表達水平的檢測

1. 酶聯免疫吸附反應(EL ISA)技術

酶聯免疫吸附試驗(E nzy me一Linked Immunosorbent Assay, EL ISA)用于檢測表達的目的蛋白，其基本原理是抗原抗體的特異性結合和酶對底物的高效催化。將針對目的蛋白的抗體包被在ELISA板上，加入待測物的溶液，經保溫如待測物中含有轉基因片斷的表達產物即相應的蛋白，該蛋白作為抗原與包被的特異性抗體相結合。加入酶標記的針對目的蛋白的抗體，再經保溫后加入酶反應底物顯色，以酶聯閱讀儀測定OD值。

2. 蛋白芯片

蛋白芯片的操作過程和基因芯片是一樣的，只是其原理是利用抗原抗體的特異性結合而不是堿基對的互補雜交。

3. Westertern印跡法

Western印跡法的原理和Southern雜交、northern印跡雜交的原理相似，是抗原抗體的特異性結合。把從樣品中提取的蛋白質用凝膠電泳分離成大小不同的分子作為抗原，并將其轉移到固體支持物上，用含有放射性標記的抗體做探針與之雜交，通過放射性自顯影檢測外源基因的表達產物。Western印跡法與EL ISA所用都是抗原抗體的特異性結合，標記探針不同而已。一個為放射性標記，一個為酶標記。

轉基因食品檢測的發展方向和趨勢

由于轉基因食品直接關系到人們的身體健康和切身利益，所以對轉基因食品的檢測要求快速、準確、實用、操作簡便。轉基因食品的檢測正朝著試劑盒的方向發展，DNA芯片技術在未來的轉基因檢測中的作用也越來越突出。


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