圖5: 長讀長實時測序原理。
長reads的合成
與真正測序的平臺不同的是，合成長讀長技術依賴于一個barcode系統來結合不同的片段，通過已有的短讀長測序儀來獲得長讀長reads61。該方法將大的DNA分子分割成若干個小片段到微孔中或者乳液中。每個微孔或者乳液中的模板被切割并且加上了barcodes。這種方法允許在短讀長測序儀上使用，測序后數據被通過barcode分開按照barcodes的序列進行拼接62。
合成法有兩個系統：Illumina長片段合成平臺（圖5c）與10X
Genomics乳液系統（圖5d）。Illumina系統（Moleculo）分割DNA到小板上而不需要特殊儀器。然而，10X
Genomics乳液系統（GemCode與Chromium）使用乳液分隔DNA并且需要微流體平臺（microfluidic
instrument）來進行測序前的準備工作。在其實濃度低至1ng的情況下，10X
Genomics乳液系統可以任意切割長的DNA片段（最大達到100kb）到微粒（GEM）中，這種威力一般包含了≤0.3×
的基因組以及一個獨特的barcode。
單分子測序與合成法測序的比較
人們對長讀長測序越來越感興趣，每個系統都有其優劣（表一）。最近長讀長測序最受歡迎的是PacBioRS
II。該設備可以產生超過50kb長度的單個read，長鏈建庫測序平均長度為10-15kb。這種特性使得在基因組拼接與大范圍基因組結構的應用中大有好處63,64。但是，長鏈的單個堿基錯誤率在15%左右65，使得人們對該儀器的使用有所顧慮66。不幸的是，這些錯誤隨機分布每個reads，也因此必須有足夠高的覆蓋度來消除單個堿基錯誤率的負面影響67。
PacBio的環狀模板有時候也會出現錯誤。單個堿基測序次數越多，結果就越可靠，其最高準確率達到99.999%59,68。其高準確率與Sanger測序相似，使得該方法與Sanger測序一道成為SNPs的研究方法65。該設備的運行時間與通量受測序讀長的影響，長的模板需要更長的時間。舉例來說，1kb的庫運行1小時測序每個分子可以產生7500個堿基，平均大約重復8次；而運行4小時每個分子可以產生大約30000個堿基（大約重復30次）。相反的是，10kb的庫運行4小時產生30000個堿基只能重復3次左右。通量的限制以及高企的成本（1000美元/G），加上較高的覆蓋度使得PacBio
RS II成為那些較小的實驗室難以應用的技術。然而，考慮到這些問題，PacBio推出了Sequel系統，其通量與RS
II相比高出了7倍，使得30×覆蓋度的人類基因組測序成本大幅下降一半69。
ONT MinION是一個小的（~3 cm× 10
cm）USB設備，并且可以在個人電腦上運行，使得其成為最小的測序平臺。這使得MinION具有極高的便攜性，并且在臨床診斷中以及那些不容易到達的地方有著廣泛的應用前景。盡管周邊設備依然只有在實驗室中才有，如文庫準備的恒溫器，這依然可以大幅減少設備空間。與其他平臺不同，MinION在片段大小上是有限制的。理論上來講，任意大小的DNA分子都可以在該設備上測序，但是實際情況是在對長片段進行測序過程中，是有所制約的70。作為ONT技術本身的特性，ONT擁有超過1000種獨立的信號，這使得ONT擁有巨大的錯誤率——1D
read大約在30%左右（主要是indel）。有效的對核糖核酸復合物的測序也是ONT
MinION面臨的一大問題。當核糖核酸復合物超過k-mer長度，就很難準確鑒定前一個k-mer何時離開孔而下一個k-mer何時進入孔。因為修飾的堿基會改變原有的k-mer設定的電壓變化，所以堿基的修飾對MinION而言同樣也是一大挑戰。幸運的是，最近的一系列的對試劑以及算法的改進使得其準確率提高不少71。