三、以AD發病的遺傳學為基礎的轉基因動物模型
（一）Aβ假說
自從Alzheimer于1906年首次報道進行性記憶和認知功能減退的AD患者以來，以發現者名字命名的該疾病一直困擾著人們。Alzheimer注意 到病人的大腦有NFT和血管外的SP病理改變，但不能區分這是致病因子或僅僅是疾病的標志物。直到20世紀末，隨著分子生物學方法及相關科學的進步，才使 人們加深了對AD的認識。1991年在基因相關分析研究中人們發現了重要的線索：β淀粉樣蛋白前體（Amyloid beta-protein precursor，APP）基因的錯義突變會導致常染色體顯性遺傳的家族性AD（FAD）的發生，這些突變發生在APP的Aβ編碼區[14]。隨后又發 現與AD發病有關的其他3個基因，分別是14號、1號和19號染色體上的早老素1（prsenilin-1，PS1）基因、早老素 2（prsenilin-2，PS2）基因和載脂蛋白E4（apolipoprotein E4，apoE4）基因[15，16，17]，它們的突變或多態型會使AD發病的危險性增加。APP、PS1和PS2基因主要與FAD有關，FAD病人至 少有其中之一的異常，大約10%的FAD和2%散發性AD存在APP基因突變，而PS基因突變的患者則高達40%～50%[17]。ApoE與FAD和散 發性AD都有關。與FAD相聯系的每一個基因改變以及從基因型到表型的改變的闡明使人們形成一個共識，即至少FAD的形成是這樣開始的。故而人們把研究目 光轉向了形成SP的主要成分Aβ上，經過一系列的研究之后，在其代謝的關鍵酶α、?、γ分泌酶（secretase）的確立及其代謝的分子機制方面取得了 一些進展。這些新發現加上Aβ易于形成具有神經毒性的蛋白，導致大腦神經元功能障礙，出現AD相應臨床表現。一種疾病發生發展過程的粗略輪廓開始浮現，逐 漸形成了AD發病的Aβ假說，該學說認為各種病因最終作用的結果是引起Aβ代謝異常，表現為Aβ過度產生，降解減少，Aβ聚集或沉積，引發各種免疫炎癥反 應和神經毒性級聯反應，導致廣泛的神經元變性和細胞功能障礙、突觸缺失及因凋亡或死亡引起神經元減少等一系列的病理生理變化，最終導致AD發生。因 此，Aβ沉積是AD發病機制的始發因素和中心環節[18]，自然成為AD研究的主要方向和熱點，同時也為治療AD帶來了新的藥物作用靶點。
（二）轉基因和AD轉基因動物模型
人們發現AD以上基因突變的同時，便開始借助新出現的轉基因技術，將已發現的人類的4個突變的外源性基因轉入動物體內來制備轉基因動物模型，這已成為動物 模型制作中一個比較新的方法，該方法將FAD相關的人類突變基因轉入動物中，并使外源性基因穩定遺傳，改變動物遺傳學性狀，達到在動物體內模擬人類FAD 遺傳特征的目的，并以此來篩選針對Aβ靶點的AD治療藥物。
轉基因是將外源性基因引入基因組，并使外源性基因穩定遺傳的方法。在過去的15年間，外源性基因轉入哺乳動物基因組已成常規實驗操作方法。傳統的方法是將 目的基因通過顯微注射導入單細胞受精卵中，存活的受精卵移植到假孕動物的子宮內發育成個體。部分受精卵在尚未分裂時，外源性DNA已整合、進入動物染色體 組。由這種卵發育而成的動物，由于其外源性基因整合進了生殖細胞，因而能穩定地將外源性基因遺傳給子代。隨著胚胎干細胞（embryonic stem，ES）技術的出現，以及同源重組基因打靶策略的發展，研究者能探尋特定基因的功能，并且能弄清楚基因的精細改變對基因功能的影響以及在體內產生 的特定效應。這種新的有效轉基因技術是首先建立ES細胞系，從發育中的囊胚內細胞團中取出細胞，在滋養層上或有分化抑制活性的培養基上傳代以維持去分化狀 態，然后通過電擊、轉染、微注射等方法將外源性基因轉入ES細胞，細胞經篩選后再送入囊胚，囊胚移植入假孕雌性動物體內發育成個體。這樣出生的個體與傳統 的單細胞受精卵經顯微注射的個體相比，多為嵌合體，因為攜帶轉入基因的細胞只占整個囊胚的一部分。只要攜帶有外源性基因的細胞能發育成生殖系細胞，通過育 種就可以建立轉基因系。將外源性基因導入ES細胞要優于單細胞受精卵的顯微注射，因為可以設計外源DNA，使之與內源的同源序列發生同源重組。 Southern blot或PCR篩選后，可以鑒定出正確打靶的ES細胞克隆，經囊胚注射入宿主囊胚后發育成所要的嵌合體。
轉基因動物可在體內研究某一特定致病基因的作用，是研究AD獨特而重要的模型。轉基因動物分為兩類，第一類是含有無效基因的小鼠——基因敲除鼠 [19，.20]。它們通常用于了解敲除的基因在AD病因中的功能，與此同時它們可以再插入相關的人類突變型基因，以避免內源性小鼠基因可能的干擾作用。
第二類是AD轉基因小鼠表達AD突變的致病基因，從而表現出相關的AD表型的病理特征，通過對已存在的AD轉基因小鼠相雜交，附加額外的基因或因此來創造 轉雙基因或多基因的小鼠。這樣使得人們能對這些不同AD相關因素的相互作用進行研究[21，22]。基于遺傳背景、繁殖能力、操作難度和經濟等方面考慮， 目前的轉基因動物多選用小鼠。現有多種轉基因小鼠均可表達與AD病變有關的基因如APP、APP的C末端片段、tau、PS1、PS2、ApoE等。
1.制備Aβ沉積的轉基因小鼠所需要的參數
在構建一個轉基因小鼠時，啟動子的選擇對于決定其時間和空間的表達模式及基因的拷貝數起重要作用。小鼠轉APP和PS1基因的表達有15個不同的啟動子。 這些小鼠已成功的復制出AD的一些病理特征，如Aβ的過量產生和淀粉樣沉積。有些也通過轉基因啟動子產生并得到普遍應用，如APP啟動子[23]、朊病毒 蛋白啟動子[24]和PDGF-β[25]，均導致神經系統以外的一些表達，而Thy-1[26]啟動子則是神經元特異表達。啟動子的選擇同樣影響到成功 復制Aβ沉積建立轉基因小鼠所需要的一個參數——轉入基因的過度表達。早期的轉基因鼠系使用的是FAD的APP等位基因，但并沒有顯示出AD的任何病理特 征。這是由于轉入APP基因的過低水平，大概只有內源性鼠APP基因的1.3到1.4倍造成的[27]。
第二是鼠系的選擇問題，因為至少8個不同的鼠系被用來制作過度表達APP的轉基因小鼠[24，26]及表達PS基因（PS1和PS2）[28]。除了 APP和PS1轉基因鼠系產生于FVB/N株系[15，47，72]，所有的其它轉APP和PS1的小鼠都是建立在雜交鼠系上。雜交鼠能制造出更大的容積 并且有更強健的胚胎[29]。轉基因所用的鼠遺傳背景將對鼠系的維持和行為測試結果有明顯的影響。由于雜交鼠系攜帶有一些不良的特征，轉基因動物使用這些 鼠系時，將會帶有這些特征。這些不良特征包括FVB/N，CBA和C3H遺傳背景中的視力受損，DBA和129鼠背景中腫瘤的高發性，SJL雜交鼠系有一 更高水平的攻擊性和C57鼠出現年齡依賴耳聾[30]。另外，C57鼠顯示出年齡依賴的病理損害聚集，和淀粉樣沉積相似，但能與其分辨開來[31]。含有 這些損害特征的雜交鼠在依賴視覺系統的學習記憶測試中，如Morris水迷宮中會影響其成績。對于行為學測試包括學習記憶，最好的鼠系選擇卻是 C57B1/6J雜交鼠系。這個鼠系能較好適應Morris水迷宮、八臂迷宮和條件空間變換測試[29]。Carlson等[32]在研究小鼠的遺傳背景 對其表型的影響時，發現具有B6xSJL雜交遺傳背景能產生SP的Tg2576小鼠回交至C57B1/6J鼠時，每一個雜交的后代轉基因的傳遞和子孫的存 活率都降低了。C57B1/6J背景使轉APP基因小鼠的生存能力降低，其能力在Borchelt等培育的APPswe小鼠和C57B1/6J鼠系之間， 資料表明遺傳背景對存活狀態、行為及與APP過度表達相關的病理都有明顯的影響。
在成功復制Aβ沉積的轉基因小鼠模型建立以前，人們預測存在以下一些問題：轉入基因的異位表達，完全APP異構體缺乏和APPs-α下調的缺乏。為了解決 這些潛在的問題，酵母人工染色體技術(yeast artificial chromosome，YAC)被用于產生轉基因鼠系。Lamb等[33]通過導入編碼人類APP基因400-kbp DNA建立起轉基因小鼠，該類小鼠采用正確表達模式表達所有的APP剪切體亞型；第二個問題是，在小鼠中可能僅僅是復制出正常APP的水解和APPs-α 產量的減少。APPs-α已報道具有神經營養作用[35，36]和神經保護作用[37]。為了驗證這個假說，人們將含有瑞典突變Aβ的序列代替轉基因鼠系 中的Aβ序列 [38]。這個方法的優點是沒有增加APP的表達，其表達未超過正常水平并且沒產生外源性APP表達。與正常人類衰老的大腦相比，一個1.3到4.5月月 齡的這種轉基因小鼠大腦內的Aβ產量增加9倍。當APPswe突變存在時，估計這些小鼠的APPs-α產量可能減少。人們已在這些小鼠中觀察到，Aβ產生 增加和APPs-α分泌減少在神經元存活方面有潛在作用。進一步的證據表明，減少APPs-α分泌可能在成功復制AD小鼠模型中起作用。最近的一項研究表 明，在Swiss小鼠腦室內注射APPs-α能提高記憶能力[39]。因此，在將來的轉基因鼠研究中應當審慎地去監測Aβ增加和APPs-α減少的潛在神 經病理作用。