抗體的選擇和保存

當我們要檢測目的蛋白在組織中表達情況的時候，如何選擇適合我們實驗需要的抗體，并恰當保存使用，是每個科研人員需要細心考慮的。抗體種類繁多，品牌眾 多，技術參數不一，價格和質量更是相差甚大，如何購買到高質量價格合適的抗體，并準確地做出我們想要的結果，其中有很多細節需要注意。

一、怎樣選擇適合你實驗需要的抗體？

1. 一抗選擇要點

（1）確定抗體的名字，注意中英文名字、它名、亞型等信息。

（2）確定你的實驗類型，Elisa，WB，IHC，ICC，還是FACS。一般抗體的說明書都會列出該抗體經驗證過適用于何種實驗的類型，如果抗體說明 書沒有提及的應用類型，并不意味著該抗體不適用于此種分析應用類型，而僅是說明尚未經過此種實驗驗證，請根據說明書列出的已驗證的類型來選擇適合你實驗的 抗體。

（3）確定實驗樣本的種屬，Human，Mouse，還是Rat。一般抗體說明書都列出該抗體經試驗驗證過適用于何種物種實驗，請根據說明書列出已驗證的種屬來選擇適合你實驗的抗體。

（4）樣本蛋白的結構性質。了解樣本蛋白的結構性質有助于選擇最合適的抗體，待測樣本蛋白的結構域和樣本在提取和處理過程中是否會變性，蛋白空間構象的改變，會影響抗體的免疫親和反應。

（5）單多克隆抗體的選擇。市面上的抗體還是以多克隆抗體為主，一般單克隆抗體特異性強，但親和力相對小，檢測抗原靈敏度相對就低；而多克隆抗體特異性稍弱，但抗體的親和力強，靈敏度高，但易出現非特異性染色（可以通過封閉等避免）。

2. 二抗選擇要點

（1）種屬來源。主要根據一抗種屬來源來決定購買二抗來源，如一抗是小鼠來源，那二抗就買抗小鼠的即可（羊、兔等均可）。

（2）標記物的選擇。有HRP、Biotin、熒光素等標記物。一般SP三步法二抗選擇Biotin標記的二抗，以與后面的SP結合反應，而免疫熒光染色就需要購買不同熒光素標記的二抗，如羅丹明、FITC、Cy3等常用熒光素。

二、抗體的穩定性

1. 抗體的穩定性是自然界長期進化的結果。抗體是免疫系統中最重要的分子之一，其穩定性是自然進化篩選的結果。在眾多物種中，抗體分子形成了保守而穩定的結構。

2. 抗體分子的高Tm值。在室溫下，甚至短時間溫度達到50-60℃，抗體分子都能維持正確折疊，保持應有的活性。

3. 抗體的純度。采用先進的抗體純化技術，確保抗體產品的高純度，保障其抗體產品的穩定性。

4. 抗體的濃度。高濃度的抗體產品可減少容器表面吸附造成的物質損失，高濃度的抗體穩定性更好，抗體產品中93%的濃度大于0.5mg/ml。

三、怎樣確定抗體購買渠道和品牌？

國外著名抗體品牌的質量一般沒問題，但價格較貴，而且很多抗體品牌本身不生產抗體，所以能找到OEM抗體生產商生產的原裝進口抗體，隨著網絡技術的越來越普及，我們自己就可以通 過國內外的相關網站來檢索，來查找我們所需要的產品資料。

四、怎樣保存已獲得的抗體？

抗體無論是保存還是運輸都應盡可能地避免反復凍融，收到抗體后請根據實驗的需要，對抗體進行分裝，避免同一管抗體反復凍融（反復凍融會導致抗體空間結構變 性，導致多聚體形成，從而降低抗體的結合能力）。抗體保存得當與否，直接決定了抗體的活性和使用效果，如果抗體保存得當，抗體活性大部分都可以維持數年。 請謹記，無論何時請按照說明書推薦的保存條件正確處理和保存抗體。

1. 收到抗體后，請務必在4℃，12000rpm，離心3分鐘，（無論是液體還是凍干粉狀態），再打開管蓋進行分裝和保存（如果抗體體積小于50ul，請延長 離心時間至5分鐘，以保證全部抗體均離心下來）。抗體一般使用特制的儲存管，只有在12000rpm離心3分鐘，才能將附著在管壁或蓋內的抗體全部離心下 來（即使是在10000rpm離心也會離心不完全，導致出現抗體的量不足的現象）。

2. 對于ProSci大部分抗體，比較合適的保存方式是，分裝后保存在-20℃或者-80℃。

（1）對絕大多數抗體來說，保存在-20℃就完全足夠了，沒有任何證據顯示保存在-80℃會更好。

（2）分裝可以最大程度的降低反復凍融對抗體活性的損害，同時也降低了由于多次從同一管中吸取抗體造成的污染可能性。

（3）分裝的量以一次實驗用完為好，最少不能少于10ul每份。因為分裝體積越小，抗體的濃度越可能會受到蒸發以及管壁吸附的影響。

（4）復融后的分裝抗體如果一次用不完，將剩余母液保存在4℃，避免再凍起來。

（5）抗體工作液應該當天配制當天用完，4℃保存盡量不要超過1天。

（6）絕對避免將抗體保存在自動除霜冰箱中，將抗體保存在冰箱里層，避免溫度變化造成反復凍融。

3. 大部分抗體收到后4℃短暫保存1~2周對抗體活性沒有影響。

4. 大部分抗體的運輸條件：一般的運輸過程需要1~2周的時間，所以是在低溫4℃的條件下來完成的。

4℃運輸最主要的目的是為了避免反復凍融對抗體活性的損害（如果使用干冰運輸，那么收到時抗體是凍起來的，為了分裝就需要解凍，這就多了一次凍融的過程），所以運輸過程中絕對避免干冰運輸。

關于疊氮化鈉（sodium azide）的使用：

為了防止微生物污染，疊氮化鈉經常被加入到抗體中（終濃度0.02% (w/v)）。ProSci的絕大部分抗體已經含有了0.02％-0.05%的疊氮化鈉，在說明書的儲存緩沖液中有標明。

注：疊氮化鈉的去除方式

可以通過凝膠電泳或過濾的方式去除，IgG的分子量是150kDa（IgM約600kDa）；疊氮化鈉的分子量只有65Da，使用截留分子量為14kDa的濾膜即可將疊氮化鈉從抗體中去除。