應用FLIPR鉀離子通道檢測試劑盒對hERG通道阻斷...（一）

應用FLIPR 鉀離子通道檢測試劑盒對hERG通道阻斷劑特性的分析

簡介

藥物誘導的hERG (human ether-a go-go-related gene) 離子通道被阻斷可能導致嚴重的致死性室性心律失常——尖端扭轉型室性心動過速（torsade de pointes, TdP）。近年來，一批FDA 已批準藥物由于其對hERG 的脫靶效應而被迫從市場上撤出。由此，愈發凸顯了在藥物研發早期階段開展候選藥物hERG 安全性篩選的重要性和快速增長的需求。本文重點闡述了一種新型鉀離子通道檢測試劑盒在FLIPRTETRA 高通量實時熒光成像分析系統上對hERG 陽性化合物的效應進行了評估和檢測。實驗根據鉀離子(K+)通道對鉈離子(Tl+)的通透性，采用了對鉈離子敏感的熒光染料作為指示劑。實驗對幾種常見的hERG 陽性抑制劑的藥理效應進行了檢測，結果與IonWorks Barracuda? Plus 全自動膜片鉗系統得到的數值作比較。

材料和方法

FLIPR 鉀離子通道檢測試劑盒（圖1）含有鉈離子敏感的指示染料。在開始染料加載步驟中，含有乙酰氧基甲（AM）酯的鉈離子指示染料通過被動擴散方式穿過細胞膜進入細胞內部。細胞質酯酶剪切掉乙酰氧基甲（AM）酯并釋放出其激活的熒光形態。另外，在細胞外采用了ZL的屏蔽染料技術從而降低了背景熒光信號的干擾。可通過向細胞溶液中加入混合的K⁺和Tl⁺或包含了Tl⁺的配體來激活鉀離子通道。熒光信號的增強表明了鉈離子特異性地通過鉀通道進入細胞內，從而對鉀通道活性進行了功能性檢測。

FLIPR 鉀離子通道檢測試劑盒(Molecular Devices cat. #R8222) 含有Tl⁺敏感染料、屏蔽染料、200 mM K₂SO₄、50 mM Tl₂SO₄、5X 不含氯離子的緩沖液以及HBSS + 20 mM HEPES 緩沖溶液。每個包裝的試劑盒可以完成10 塊96，384，或1536 孔板。實驗檢測流程見圖2。

化合物準備

疏水性化合物由于非特異性結合到化合物板等實驗耗材中，會影響到其顯著的效能值。在本實驗中，化合物首先在100%DMSO 中被稀釋，然后在實驗前立即轉移到含HBSS+ 20 mM HEPES 緩沖溶液的玻璃襯里的多孔板中。

實驗步驟

細胞穩定轉染了人Kv11.1（hERG）離子通道的中國倉鼠卵巢（CHO）由ChanTest 公司（Cleveland, OH）提供。實驗開始2 天前在黑壁底透的384 孔板中按照每孔6500 個細胞的密度種植細胞，培養基中包含了篩選抗生素并在37℃和 5% CO₂ 條件下培養。實驗前24 小時生長培養基更換為含四環素的誘導培養基。實驗前4 小時細胞從37℃轉移至 28℃條件下培養以增加hERG 通道的表達。然后細胞板加入染料在室溫下避光孵育一小時。

為進行藥理學特性分析，先加入hERG通道阻斷劑并在室溫下孵育30 分鐘。FLIPR^Tetra 系統在實驗檢測過程中向每個孔中加入之前優化好的緩沖液。系統采用了470-495nm 的LED 激發光源和515-575nm 的發射濾片。為進行對比，使用FluxOR 試劑盒（Life Technologies）進行了平行實驗。依照生產廠家提供的方案進行操作。數據采樣間隔為1 秒并持續140 秒。結果導出到GraphPad Prism 軟件進行分析。

實驗方案開發中首先取決于刺激hERG通道所需鉈離子和鉀離子濃度的優化。多孔板中放置多種濃度的K₂SO₄ 和Tl₂SO₄ 緩沖液。Tl⁺ 和 K⁺緩沖液用1倍濃度的不含氯離子的緩沖溶液稀釋。由于每摩爾硫酸鉈和硫酸鉀含有2 份的陽離子，因而被看作為兩倍的濃度進行處理。FLIPR^Tetra 系統在實驗檢測過程中向每個孔中加入刺激緩沖液。不同濃度誘發的信號曲線進行比較以確定最大信號對應的最優濃度值。結果顯示，產生最大hERG 信號的最優Tl⁺ 和 K⁺濃度分別是1mM 和10mM（圖3）。