ELISA原理與分類介紹（九）

6．洗板

固相免疫測定技術是一種非均相免疫測定技術，需以洗滌操作將特異結合于固相的抗原或抗體與反應溫育過程中吸附的非特異成份分離開來，以保證ELISA測定的特異性。洗板對于ELISA測定來說，也是極其關鍵的一步。洗液盡量不要溢出孔外；加洗液后要靜置1分鐘，甩去板孔中洗液后，一定要大力拍干；及時更換吸水紙，尤其是拍過酶標記物的吸水紙一定要棄去，否則可能影響試驗結果。

7．邊緣效應

使用96孔板的ELISA測定中，常發現有“邊緣效應”，即外周孔顯色較中心孔深。經研究證實在溫育中的熱力學梯度可能是根本原因之所。聚苯乙烯本身為不良熱導體，在實驗室的常規ELISA測定中，將板從室溫（通常在25℃左右）置于37℃溫箱，板也升溫時，在外周孔與中心孔之間可能存在一熱力學梯度。因此使用水浴或在將反應溶液加入至板孔中時，將板和溶液均加熱至溫育溫度（如37℃），就可以很容易地排除“邊緣效應”，并且可提高測定的重復性。

8．顯色

顯色一定要控制時間,根據試劑盒說明操作即可。一般來說，顯色時間過短，結果偏低；顯色時間過長，空白增高或者非特異性顯色增加。

9．比色

比色要注意波長的選擇。以TMB為底物和以OPD為底物的試劑盒均有使用，而前者比色波長為450nm，后者為492nm，濾光片需根據要求隨時更換。因此，容易出現濾光片錯用的問題。

其次，單波長或雙波長比色選擇的問題。所謂的單波長比色即是通常的以對顯色具有最大吸收的波長如450nm或492nm進行比色測定；而雙波長雙色則酶標儀在敏感波長如450nm和非敏感波長如630nm下各測定一次，敏感波上下的吸光度測定值為樣本測定酶反應特異顯色的吸光度與板孔上指紋、刮痕、灰塵等臟物所致的吸光度之和；非敏感波長下測定即改變波長至一定值，使得樣本測定酶反應特異顯色的吸光度值為零，此時測得的吸光度即為臟物的吸光度值。最后酶標儀給出的數值為敏感波長下的吸光度值與非常感波長下的吸光度值的差。因此，雙波長比色測定具有能排除由微滴板本身、板孔內標本的非特異吸收、指紋、刮痕、灰塵等對特異顯色測定吸光度的影響的優點。由于ELISA測定中單個空白孔的非特異吸收上有一定程度的不確定性，也就是說每次測定或同次測定空白孔位置的不同均有可能得到不同吸光度測定值，故而在ELISA測定比色時，最好是使用雙波長比色。

綜上所述，盡管ELISA測定的操作步驟非常簡單，但有可能會影響測定結果的因素卻較多，分布在測定操作的各步之中，尤以加樣、溫育和洗板為甚。為幫助大家分析查找測定中出現問題的可能原因，特對常見問題及原因歸納總結于下表。

操作過程中可能出現的問題和解決方法