RealTimePCR實驗流程

實驗試劑

Total RNA Kit ：Omega：(Cat.No．R6834)

First Strand cDNA Synthesis Kit：GeneCopoeia(Cat.No．C0210A)

2xAllinOneTMQ-PCRMix：GeneCopoeia（cat.No．D0101A)

Primer synthesis：invitrogen

實驗設備

Real Time PCR：ABI

實驗材料

樣品為5個人源的細胞培養液，其編號分別為：NO.I、No.2、No.3、No.4、No.5，其中No.1為對照組，其它四個為不同的樣品組。

實驗步驟

1. RNA抽提

1) 樣品處理：取適量樣本加入 1ml TRK 裂解液勻漿樣品。室溫 14,000 × g 離心 5 min去除不溶解的的雜質，小心轉移上清至 1.5ml 離心管。

2) 加入等倍體積 70% 乙醇至裂解液中，抽打或渦旋混勻。

3) 將柱子套在收集管中，轉移混合液至柱子中。室溫 10,000 × g 離心 30-60 秒，棄去濾液。

4) 把柱套放新收集管中，加入 300ul RNA Wash Buffer I 至柱子上，按以上條件離心，棄去濾液。把柱套放回收集管中。

5) DNase 消化: 配制 DNASE 消化液( Digestion Buffer, 73.5ul ; RNase-Free DNase I,1.5ul) ,混勻, 將消化液轉移至柱子膜的正中央，室溫靜置 15 分鐘。

6) 加 500ul RNA Wash Buffer I 至柱子，按以上條件離心，棄濾液。

7) 把柱套放回收集管中，加 500ul RNA Wash Buffer II 至柱子上，按以上條件離心，棄濾液。

8) 把柱套放回新收集管中，加 500ul RNA Wash Buffer II 至柱子上，按以上條件離心，棄濾液。

9) 把柱套放回收集管中， 10,000xg 離心空柱 2min 以甩干柱子基質。

10) 把柱子裝在 1.5ml 離心管上，加入 30-100ul DEPC Water 柱子基質上，室溫靜置 2min 。10,000xg 離心 1min 洗脫出 RNA 。

11) RNA濃度測定

吸取lul抽提的RNA用DEPC水稀釋10倍后．在Nanodrop上測定RNA濃度，以DEPC水做空白對照，同時記錄RNA濃度及其OD260／OD280。

2. RNA電泳檢測

1) 變性膠制備

取1gAgarose 75ml去離子水煮沸，冷卻至70℃左右加入10ml 10×Mops和15ml 甲醛及EB。倒膠至寬口梳子的膠板上，蓋上蓋子。

2) 電泳緩沖液配制(1×Mops)

取50ml 10×Mops。用去離子水稀釋至500ml，倒入電泳槽中，再在電泳緩沖液中添加EB。

3) RNA樣品處理

取RNA 樣品3u1．10×Mops 2u1．最后補充DEPC 水至20ul，65℃變性10min 后立即冷卻．加入2ul 10×RNA loadingbuffer即可電泳。

4) RNA電冰

先把RNA 膠放入電泳槽中，100V 作用電泳約5min，再在點樣孔中點入處理過的RNA 樣品，100V左右電泳至溴酚藍至膠的2／3處，取膠拍照。

3. 反轉錄

1)  融解反應所需的試劑，上下輕微顛倒混勻，進行短暫離心后放置冰上待用。

2) RNA-Primer Mix的配制反應（所有反應液的配制都在冰上操作）在預冷的RNase free 的反應管內加入以下試劑至總體積13μl。

試劑組分                               體積                        終濃度

Total RNA                                                               1μg

60μM Oligo（dT）18           1μL                           2.4μM

DEPC 水                                至總體積13μl

3) RNA變性

混勻RNA-Primer Mix，進行短暫離心，65℃變性10min后立即放置冰上。

4) 配制反轉錄反應液

在RNA-Primer Mix反應管內加入以下試劑至總體積25μl。

試劑組分                             體積                終濃度

RNA-Primer Mix                 13μl

5×RT Reaction Buffer            5μl                 1×

25mM dNTP                          1μl                  1mM

25U/μl RNase Inhibitor         1μl                  1U/μl

200U/μl M-MLV RTase        1μl                  8U/μl

DEPC水                                 4μl

總體積                                  25μl

5) 反轉錄反應

混勻反應Mix，短暫離心后42℃孵育1h。

6) 滅活并保存反轉錄產物

反應結束后，85℃滅活處理5min，最后-20℃保存反轉錄產物。

4. 定量PCR實驗

采用染料法（SYBR Green I）進行相對定量分析，實驗設計是按照ΔΔCt解析法來進行設計。實驗步驟如下：

1) 將2XAllinOneTMQ—PCR Mix在室溫下融解．輕柔得上下顛倒混勻并進行短暫離心。同時在使用過程中始終保持避光。

2)  PCR reaction mix的制備 (在冰上操作)

試劑                                                用量                  終濃度

2XAllinOneTMQ—PCR Mix         10μl                   1×

ddH₂O                                              1μl

PCR Forward Primer（4μM）       2μl                     0.4μM

PCR Reverse Primer（4μM）        2μl                     0.4μM

cDNA                                               5μl

總體積                                            20μl

注意：在實驗中也設計了NTC(No Template Control)，其為陰性對照，即在反應中用水來代替模板cDNA，其它試劑不變．從而來質控是否體系有污染。迅速將PCR reaction mix稍混勻，并加入8聯管中。

3) 將8聯管進行短暫離心，確保所有反應液在反應孔底部。

4) PCR 反應，采用了標準的三步法程序進行反應：

循環數           步驟              溫度               時間          檢測

1                     預變性           95℃              10min         Off

40                   變性               95℃              10sec          Off

退火               57℃              20sec              Off

延伸               72℃              15sec              On

5) 在PCR 反應后．采用以下的程序進行熔解曲線分析

溫度              溫度間隔      時間           檢測

72℃~95℃    0.5℃             6sec/each    On

30℃                                    30sec           off