基于動力學校準大鼠腦組織中內源性神經酰胺定量iMSI

再帕爾?阿不力孜科研團隊 第65期

中國醫學科學院藥物研究所

天然藥物活性物質與功能國家重點實驗室

文獻整理：金波 指導教師：賀玖明

　　 美國伊利諾伊大學香檳分校的Jonathan V. Sweedler團隊在《Analytical Chemistry》上發表了一篇題為“Quantitative Imprint Mass Spectrometry Imaging of Endogenous Ceramides in Rat Brain Tissue with Kinetic Calibration”研究論文，基于標準品與分析物吸附與解吸之間的動力學特性，采用預加載標準品的二氧化鈦-多巴胺（TiO2-DA）整體層，對組織切片印跡進行定量質譜成像。

　　背景介紹

　　 許多MSI研究已從分析物鑒定轉移到比較大腦區域之間的分析物水平。由于組織的組成不同，即使在大腦的鄰近區域，也需要能夠解決化學異質性的方法。目前已有不同的樣品制備技術，目的是在樣品表面獲得確切的標準品濃度，從而進行定量分析。但是，內源性分析物與在組織中的加標標準品之間的傳質速率差異使得難以對化學性質和結構復雜的生物樣品進行定量。

　　實驗設計

　　1 印跡質譜成像（iMSI）流程（圖1）：

　　 （A）TiO2-DA整體涂層的制備：在乙醇水溶液中使用正丁醇鈦（IV）水解制備TiO2納米顆粒溶液（溶液I）；將250μL溶液I在含有0.005 M多巴胺鹽酸鹽的5 mL 5％水-乙醇溶液中稀釋，然后孵育1 h（溶液II）。與目標距離保持50cm左右，使用噴槍在ITO載玻片上持續噴涂溶液II 5分鐘，使TiO2-DA層的最終密度為?400μg/cm2。將包含10μg/mL標準品溶液的0.5μL小滴陣列點樣至TiO2-DA整體層上。（B）將腦組織切片壓印在TiO2-DA整體層上并噴涂ACN潤濕使發生吸附和解吸。（C）沖洗整個樣品來去除組織切片，然后在?25°C的N2室中干燥TiO2-DA整體涂覆的ITO玻璃載玻片。進行激光解吸電離質譜成像（LDI-MSI）分析。

圖1使用TiO2-DA整體層和動力學校準的定量iMSI的樣品制備和分析過程的示意圖

　　2 直接的組織表面輔助激光解吸電離質譜成像（SALDI-MSI）：

　　 將腦組織切片置于ITO載玻片上。使用噴槍施加溶液II，并在環境條件下快速干燥。將包含10μg/mL標準品溶液的0.5μL小滴陣列點樣至TiO2-DA整體層上。使用噴槍噴涂ACN。為了比較不同樣品制備條件下的校準結果，改變溶液II和ACN的氣壓和噴涂時間以提供濕潤或干燥的條件。進行LDI-MSI分析。

　　3 LDI-MSI分析條件：

　　 TiO2-DA整體層輔助LDI飛行時間（TOF）/ TOF MSI（適用于SALDI和iMSI）均使用UltrafleXtreme II質譜儀（Bruker），配備固態UV Smartbeam II激光器。MS質譜圖的m/z范圍為20-3000。DHB、緩激肽和血管緊張素II的混合物沉積在腦組織區域附近，用于質譜重新校準。

　　結果與討論

　　1基于TiO2-DA輔助的iMSI

　　 iMSI能夠檢測磷脂和其他Lewis堿性脂質。iMSI簡化了分析物的環境，因此降低了基質的影響，并提高了目標分析物的靈敏度。但其重現性和定量性能尚待確定，因為將分析物從生物組織轉移至成像的表面取決于生物組織的性質。為了解決這些差異，在iMSI的基礎上采用動力學校準方法。

　　 對比SALDI MSI和iMSI結果，兩種方法均能觀察到相同的主峰，但峰的相對強度不同（圖2）。在700-900 Da的質量范圍內，PC和PE信號在iMSI中產生了更高的相對峰強度。而在200-700Da的質量范圍內，iMSI的大多數峰強度比SALDI-MSI低5-10倍。m/z 200-700范圍內的大多數峰代表脂肪酸（m/z 200-400）、膽固醇（m/z 400-500）、神經酰胺和二酰基甘油（m/z 500-700）。觀察到的峰強度差異的可能解釋為TiO2-DA材料與常見的Lewis堿（例如脂肪酸的羧基、膽固醇的羥基和神經酰胺的氨基）的親和力較低。因此，在與磷脂的競爭結合下，小分子（如脂肪酸）的吸附效率會降低。此外，盡管iMSI中使用了多步驟樣品處理方法，但檢測到的化合物的空間分布與SALDI MSI所觀察到的結果相似。例如，兩種方法產生的神經酰胺和PE離子的空間分布相似（圖2）。此外，iMSI在分子圖像中產生了更好的對比度，這表明在iMSI樣品制備過程中化合物的定位得以保留。

圖2 右側的離子圖像中由黃色圓圈勾勒出的大腦區域的代表性質譜圖，其中（A-1，B-1）iMSI和（A-2，B-2）直接組織SALDI MSI，其中A為較高 m/z范圍（A，m/z 200-700），B為較低m/z范圍（B，m/z 700-900）。右側的離子圖像分別為（A）m/z 838.5和（B）m/z 588.5離子的信號分布。這些測量中使用同一小鼠大腦的相鄰部分。

　　2 比較基質效應對iMSI和SALDI MSI結果的影響

　　 通過測量微點陣列包含的脂質標準物質的信號比率以確定基質效應，兩組分別為（1）SALDI-MSI：組織切片對比干凈的ITO玻璃表面（2）iMSI：組織印跡對比干凈的載有TiO2-DA整體層的ITO玻璃表面。結果如表1所示，iMSI對神經酰胺的Na和K加合物顯示出5％至90％的基質效應。相反，SALDI-MSI對神經酰胺峰的Na加合物表現出最低的基質效應（11％），而對K加合物信號表現出最高的基質效應（1330％）。說明組織、組織印跡和空白區域在化學復雜性方面的差異（包括無機鹽成分及其含量），均影響基質效應。對于PE，iMSI方法的基質效應通常低于20％，并且在不同的大腦區域結果均相似（表1）。相反，在SALDI MSI測量中觀察到的基質效應在不同大腦區域之間具有很大的變異性，從而影響了PE的最終分子圖像。基質對腦苷脂信號的作用類似于對PE信號的作用。

　　 上述結果表明，iMSI總體上表現出較低的基質效應，而且由于降低了由基質效應引起的腦區域依賴性的變化，化學成像分析的質量和準確性得以提高。

表1基質對不同腦區中不同脂質標準品的直接組織SALDI MSI和iMSI檢測結果的影響

　　a CTX，皮質；CC，胼胝體；CA1，海馬體I區；CA3，海馬體III區；Cer，神經酰胺； PE，磷脂酰乙醇胺；CB，腦苷脂。評估所有點/像素的均值±標準差。通過測量沉積在ITO玻璃上的微點陣列所確定的脂質標準信號區域比率來確定基質效應百分比（1）組織切片和干凈的ITO玻璃表面（SALDI MSI）（n = 2動物）和（2）組織印跡和干凈的載有TiO2-DA整體層的ITO玻璃表面（iMSI）（n = 2只動物）

　　3 iMSI定量分析中的動力學校準和測量變異性補償

注：由于公式格式顯示錯誤，故采用圖片格式展示上一段內容。

　　 為了開發使用動力學校準的定量iMSI方法，選擇了神經酰胺（Cer d18:1/18:0）作為目標分析物。它以相對較低的濃度存在于腦組織中，可以用TiO2-DA輔助LDI進行檢測。將Cer d18:1/6:0作為標準品，雖然它在鼠腦組織中不存在，但它具有與內源性Cer d18相似的檢測性能。控制動力學研究的吸附/解吸時間，以及使用噴槍系統通過恒定流速噴涂不同體積的溶劑（ACN）來改變溶劑施加時間。iMSI測量結果表明，內源性Cer d18:1/18:0的吸附曲線與標準Cer d18:1/6:0的解吸曲線對稱（圖3）。但是，更長的分析物提取時間（當ACN施加時間超過5min時）導致n / ne和Q / q0之和增加。此外，K×A×S / Vs可以使用標準品的解吸曲線來計算。對于標準品Cer d18:1/6:0，K×A×S / Vs的值為1.32。

圖3 TiO2-DA整體層吸附內源性神經酰胺（Cer d18:1/18:0）的各向同性和TiO2-DA整體層解吸的神經酰胺標準品（Cer d18:1/6:0）與應用的ACN溶劑量的關系。使用噴槍以恒定的噴霧流速（?1 mL/min）在不同時間（1、3、5、7和15分鐘）將ACN施加到樣品上。噴霧覆蓋的樣品面積大于腦組織占據的面積。吸附和解吸的實驗時間隨ACN體積的增加而增加。顯示了平均值和標準偏差。

　　4 動力學校準和加標校準的比較

　　 ITO載玻片的ACN噴霧覆蓋區域比組織所占據的表面大得多，因此噴霧在組織上的液滴尺寸相對均勻。為了控制液滴的大小，調節霧化氣體（N2）的壓力以控制噴槍噴嘴處的霧化氣體與溶劑的比率。結果，所施加的溶劑液滴尺寸和溶劑施加時間的差異導致了干燥或濕潤的分析物提取條件。干燥條件：使用較高的氣壓，并減少溶劑的噴霧時間。濕潤條件：使用較低的氣壓和較長的溶劑噴射時間。

　　 基于標準添加校準方法的SALDI MSI，在濕潤條件下得到的值更大（圖4A）。與神經酰胺標準品相比，內源性神經酰胺信號強度在這些條件下具有不同的傳質動力學，從中可以得出選擇正確的內標非常重要。

　　 iMSI法在濕潤和干燥條件下的絕對濃度比在0.66和4.24之間（圖4B），而標準添加校準方法的濕干條件定量比在3.04-34.3之間（圖4A）。盡管這兩種方法都不理想，但圖4顯示，即使在極端干燥和濕潤的樣品制備條件下，動力學校準也可以實現更均勻的定量。該結果表明，TiO2-DA整體層中標準品的解吸量的變化可用于補償在不同條件下內源性神經酰胺的吸附量的變化。

圖4 使用（A）標準添加校準和（B）動力學校準在不同樣品制備條件下相同組織的MSI定量結果。所比較的大腦區域編號為1-6：海馬（1），皮質/纖維束（2），丘腦（3），尾鰭足/纖維束（4），下丘腦（5）和皮質亞板（6）。顯示了在干燥條件和濕潤條件下具有標準偏差的平均值以及平均定量結果的比率（r）。

　　5 LC-MS/MS方法驗證

　　 iMSI方法與“金標準”LC-MS/MS法定量結果的相關系數為0.9。如圖5所示，除了鼠2和鼠3的區域1的iMSI定量結果高于LC-MS/MS，其他區域的iMSI定量結果與LC-MS/MS法相似。iMSI結果相對于LC-MS/MS結果的相對回收率為72-200％, 而標準添加校準法的相對回收率為200-5000%。

　　 關于鼠2和鼠3的區域1在兩種方法之間的差異性值得討論。該區域是大腦中更具空間異質性的區域之一，包含了海馬的CA1和齒狀回細胞層。因此，可能是組織打孔和ROI采集的細微差異導致了問題。此外，當干燥ITO載玻片上的組織切片時，經常觀察到組織中出現裂縫，這些裂縫將這些大腦區域與皮質分開。因此，用高空間分辨率的MSI和良好的樣品制備方法可以減輕影響。

　　 總體而言，MSI和LC-MS/MS之間的定量結果具有可比性，其中LC-MS/MS法的精度更高。

圖5 基于動力學校準的iMSI與基于外標校準的LC-MS /MS結果的比較。直方圖說明了從六個感興趣區域（插圖中的紅色圓圈；采集的區域為海馬體）采集的樣品，紅色條為iMSI定量結果，黑色條為LC-MS/MS定量結果。（1）皮層/纖維束（2），丘腦（3），尾鰭足/纖維束（4），下丘腦（5）和皮質亞板（6）。RR表示iMSI結果的相對回收率或準確度，其計算方法是將iMSI定量結果除以LC-MS /MS結果。插圖：三只不同大鼠的大腦組織切片中Cer d18:1/18:0信號圖像。顯示了平均值和標準偏差。

　　結論

　　 在本研究中，具有預加載標準品的TiO2-DA整體層和具有動力學校準的印跡法使MSI具有可靠的半定量結果。具有Lewis堿性性質的分子（例如磷脂、神經酰胺和膽固醇）可從腦組織中解吸出來，而不會出現明顯的空間離域現象。使用印跡法可使基質效應降低，從而使測量結果可重復且在不同組織之間變化較小。利用動力學校準的定量iMSI可以補償內源性分析物在局部傳質方面的差異。使用動力學校準的iMSI和 LC-MS/MS進行比較，兩種不同的方法產生了相似的定量結果（相關系數> 0.9，結果之間的比率0.72-2.0）。

　　縮略語

　　TiO2-DA：titanium dioxide-dopamine，二氧化鈦-多巴胺；iMSI：imprint mass spectrometry imaging，印跡質譜成像；ITO：Indium tin oxide，銦錫氧化物；LDI-MSI：laser desorption ionization mass spectrometry imaging，激光解吸電離質譜成像；SALDI：surface-assisted laser desorption ionization，表面輔助激光解吸電離；DHB：2,5-dihydroxybenzoic acid，2,5-二羥基苯甲酸；ACN：acetonitrile，乙腈；PC：phosphatidylcholin，磷脂酰膽堿；PE：phosphatidylethanolamines，磷脂酰乙醇胺；Cer：ceramide，神經酰胺；

　　LC-MS/MS：liquid chromatography tandem mass spectrometry，液相-串聯質譜聯用；CA1：region I of hippocampus proper，海馬體I區；CTX：cortex，大腦皮層；CC, corpus callosum，胼胝體；CB, cerebroside，腦苷脂