凝膠過濾層析（也叫分子篩）是利用具有多孔網狀結構的顆粒的分子篩作用，根據被分離樣品中各組分相對分子質量大小的差異進行分離的技術。
凝膠過濾層析（GF）法又稱為排阻層析或分子篩方法，主要是根據蛋白質的大小和形狀，即蛋白質的質量進行分離和純化。層析柱中的填料是惰性的多孔網狀結構物質，多是交聯的聚糖（如葡聚糖或瓊脂糖）類物質，使蛋白質混合物中的物質按分子大小的不同進行分離。也叫做分子排阻層析（molecular-exclusion chromatography）。一般是大分子先流出來，小分子后流出來。凝膠過濾層析非常適合對pH變化、金屬離子或輔助因子濃度以及大環境情況敏感的生物分子。
為了進行分離，將凝膠填料裝柱形成柱床。填料是球狀顆粒的多孔填料，根據其化學和物理穩定性以及惰性（沒有反應性和吸附性）進行的選擇。在分離過程中，樣品用同溶劑進行洗脫，而在分離的后期，通常需要使用流動的緩沖液，以便移除柱子中殘余的分子，使柱子可用于下一次分離。
樣品制備：
1.樣品必須澄清，沒有顆粒狀物，否則容易堵塞層析柱。
2.樣品緩沖液：樣品緩沖液的pH、離子強度和組成不會顯著性影響結果的分辨率，只要這些參數不影響被分離蛋白質的大小和穩定性，也不超出填料的穩定范圍。
3.樣品濃度：凝膠過濾分離效果與樣品量無關，因此與樣品濃度也沒有關系。通常蛋白濃度不要超過60mg/mL。樣品的溶解性和粘度會限制樣品濃度，關鍵在于樣品相對于流動相的粘度，太高的樣品粘度會引起分離的不穩定性和不規則的流動形式，會導致非常寬和成串的峰形，反壓也會增加，因此對于粘度大的樣品需要進行稀釋。
樣品體積：在凝膠過濾中，這是最重要的參數之一。一般推薦上樣的體積在1-30%之間，可以做梯度實驗，確定最佳的上樣體積。
緩沖液組成和制備：
在凝膠過濾中，緩沖液的組成不直接影響獲得的分辨率，更重要的考慮是，緩沖液對目標蛋白分子的形狀和生物學活性的影響。選擇的緩沖液和pH需要使蛋白保持穩定性和活性。緩沖液在使用之前，應當使用0.45um或者0.22um的膜進行過濾，在進行凝膠過濾之前，必須進行脫氣處理。
層析柱：
凝膠過濾層析中，柱效尤為重要。由于分離過程中只有一個柱體積的緩沖液流過柱子，裝柱柱床和顆粒的均一性影響流過柱子的一致性，因此影響峰形和最終的峰寬。高度均一的凝膠過濾填料有助于分子的窄峰洗脫。因此要尤為注意所用柱子的柱效。所以凝膠過濾層析柱裝好之后，需要進行柱效的測定。
純化過程：
1.在開始上樣前，應將緩沖液和柱子維持在相同的溫度。溫度的快速交換會引起裝柱中的氣泡產生，影響分離。
2.樣品進樣方法取決于進樣體積和進樣使用的設備，可以通過色譜系統、蠕動泵或注射器直接上柱。
3.樣品進入凝膠過濾層析柱后，不同分子量差異的分子在柱中流動的速度不同；為了獲得良好的分離效果，應使用適當的流速，確保有足夠的時間允許分子進入或流出柱子。低流速有助于獲得更好的分辨率。如果在低流速時峰形分離良好，也可以增加流速或者縮短柱子以節省時間。
舉例一些峰形出現的可能原因（圖片源于GE）
