TaqMan miRNA的檢測能力不同，是依據采用let-7a, let-7b, let-7c, let-7d 和let-7e
5個合成miRNA來檢測低至一個核苷酸（圖7）。每個miRNA的檢測對應每個miRNA。相對探測效率是通過計完全匹配和不匹配的目標CT之間的差異，假設完美匹配的效率為100％。觀察非特異性信號處在非常低的水平，從零到0.3％，對于miRNA有2-3不匹配，0.1-3.7％的單核苷酸不同。許多交叉反應，是由RT反應反應中G-T的錯配導致的。如果miRNA之間出現超過三個不匹配，會有針對性的miRNA檢測。
我們比較歧視的TaqMan miRNA的檢測能力的不同，以解決雜交分析為基礎的檢測（圖8）。在我們的手中，雜交方法可以很好地區分let-7a和let-7b。然而，在let-7a, let-7c 和 let-7d之間，幾乎沒有區別，而是由1–3 nt區分。
我們推測，莖環引物可能會比線性引物提供更好的RT效率和特異性。依據莖環的堆放可能加強RNA-DNA的熱穩定性。此外，與傳統的線性RT引物，莖環的空間約束可能會提高檢測的特異性。我們比較的莖環和線性RT引物合成miRNA
let-7a的靈敏度和特異性(圖
9)。我們觀察到了莖環RT幾個優勢。首先，在合成let-7A目標時，線性和莖環RT方法CT值有7個數量級不同，表明莖環RT的效率高出至少100倍。其次，莖環RT在區分miRNA之間不同時，是基于ΔCT值兩個原則的不同。最后，依據7個數量級ΔCT，對于區分成熟的miRNA和其前體，莖環RT至少好100倍。
討論
由于miRNA的發現，這些基因家族的特征的顯著進展已經描繪了基因調控中miRNA功能的機制。因此，識別miRNA的生物標記特定的組織類型或疾病狀態的廣泛的研究已經開始。這些研究將會受益于miRNA準確識別和量化方法。
當前檢測和量化miR-NAs的方法主要基于克隆，Northern雜交，或引物延伸。盡管芯片可以提高miRNA譜的產量，該方法在靈敏度和特異性方面有著是相對的局限性。對于miRNA的定量，靈敏度低已成為一個的問題，因為很難放大這些短的RNA目標片段。此外，特異性低，可能會導致密切相關的miRNA、前體和基因組序列的錯誤的積極信號。最近，已報道了針對miRNA量化的修改后的侵襲物檢測。然而，侵襲物檢測特異性和敏感性有限，每檢測至少需要50
ng總RNA，或1000裂解細胞。
實時PCR是基因表達的定量的金標準。對于科學家來說，設計常規PCR，檢測平均22個核苷酸長度的miRNA，一直是一種長期挑戰來。我們開發了一種新的機制來設計TaqManPCR反應檢測，用超過現有的常規檢測方法的優越的性能來特異量化miRNA的表達水平。我們設計和驗證檢測了222個人的miRNA。這些分析相結合了PCR技術精湛的靈敏度，實時監控動態范圍和TaqMan方法報道，以增加特異性。在我們的手中，與成熟miRNA相比，miRNA前體的效果至少差2000倍。由于對于前體或基因組DNA這些檢測是不敏感的，我們可以直接添加熱處理細胞檢測，消除了樣品制備的需要。對于成熟的miRNA及其前體的檢測的需要，可用傳統的TaqMan分析法來特異地檢測前體。
我們觀察到由于堿基堆積和空間約束的莖環結構，莖環RT引物比傳統的線性引物有更好的特異性和敏感性（圖9）。堿基堆積性可以提高熱穩定性，并延長有效的RT引物/ RNA雙螺旋，可能需要相對較短的逆轉錄引物來提高RT的有效性。莖環結構的空間限制，可以防止結合基因組雙鏈DNA。因此，RNA樣品制備為消除TaqMan miRNA的需要。潛在的莖環RT引物可以為多重RT反應和小分子RNA克隆可能提供更好的效率和特異性。
對于整體miRNA譜有一個敏感的、特異地增加需求。有效高調的miRNA的能力可能會導致miRNA的生物標志物疾病或組織特異性的發現，以及有助于理解miRNA如何調節干細胞分化。我們的莖環RT-PCR方法，可以為這些研究提供了一個切實可行的解決辦法。我們目前正在開發多重辦法，要進一步提高這種方法的效用。