One Step RT- PCR PreMix（染料法）
使 用 說 明 書
【前言】
本產品提供了一個靈敏、高效、快速地擴增并檢測 RNA 的完整系統。One Step RT- PCR preMix 包
含所有 RT-PCR 所需的、并經優化的 Reaction Buffer、RT 酶混合物等，使用者只需加入適量的引物和待檢
樣品，即可進行 One Step RT- PCR 檢測。
本產品使用高效率 M-MLV 反轉錄酶和化學修飾的熱啟動 Taq DNA 聚合酶，高保真的染料，為
RT-PCR 反應提供了更高的產量及靈敏度、特異性。
【規格】
50 Reactions/Kit
【試劑盒組成】
A2010A0116s 50test
Master Mix 750μl 1 支
Enzyme Mix 500μl 1 支
A2010A0116L 100test
Master Mix 750μl 1 支*2
Enzyme Mix 500μl 1 支*2
【用戶自備的試劑、器材】
1．引物
試驗前應準備好用于檢測目的基因的引物。引物應用HPLC或PAGE純化。
2．實驗用水
使用DEPC處理的PCR用純水。
3．待檢樣品
總RNA，mRNA
4. RNasefree & DNasefree 的tip頭，離心管,薄壁PCR管等
5. 各種規格的移液器
6．Realtime PCR儀
本產品適用于下列Realtime PCR儀：ABI PRISM ? 7700、ABI PRISM ? 7500、ABI PRISM ? 7300、ABI
PRISM ? 7000、MJ Opticon 、BIORAD iCycler 、Roch LightCycler TM 等Real time PCR儀上使用，具體
使用方法請參照相應儀器的說明書。
【反應液配制】
反應液組份 加量 (μl) 終濃度 備注
One Step RT - PCR Reaction Buffer 15
Enzyme Mix 10
上游引物 5 300nM 用戶自備
下游引物 5 300nM 用戶自備
待檢樣品 5-10 10pg~100ng 用戶自備
DEPC H 2 O 5-0 用戶自備
總體積 50
注：1 通常初次使用本試劑時，可用引物濃度 300nM 進行實驗，根據實驗結果具體情況，在 200～1000nM 范圍內調整引
物濃度。
2 引物、待檢樣品的具體加量用戶可以根據實際情況調整，同時增減 DEPC 水用量，保證總反應體積不變即可。
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【RT-PCR 擴增檢測】
1 將反應管放入熒光 PCR 擴增儀進行擴增檢測。
2 循環參數設定（請參照各類儀器的操作說明進行設置）
步驟 溫度（℃） 時間 循環數（次）
1 逆轉錄反應 50 15-30 分鐘 1
2 預變性 95 5 分鐘 1
3 變性 95 10 秒
4 退火、延伸及檢測熒光 60 45-60 秒
40-50
步驟 4 中 60℃時熒光檢測，檢測通道：FAM/HEX/VIC/ROX/CY5
注：以上擴增條件為實例，用戶應根據引物的 Tm 值及擴增片段的大小來確定適合的變性時間、退火溫度，退火時間和
循環次數，黑體字部分必須保留。
【保存條件】
本產品原則上在-20℃以下冷凍保存，避免反復凍融。如果在短期內需持續使用時，融解后可在4℃
保存，最長可保存1周。
【注意事項】
1.本產品為研究用試劑。請勿作為診斷、臨床試劑用。
2.為保證實驗結果的準確性和可靠性，請特別注意以下事項：
2.1 使用已校準的移液器，選用進口一次性使用的 PCR 反應管、離心管、tip 頭等進行樣本處理及配液等操作，所有用具
應不含 DNA 酶和 RNA 酶。
2.2 引物設計過程中應盡可能避免發夾結構、二聚體等現象的發生， PCR目標片段最好小于200bp，盡可能在150bp以內。
2.3 實驗樣品盡可能新鮮，提取過程應嚴防 RNA 酶污染及操作不當導致的 RNA 降解。
2.4 使用本產品時建議對 RT-PCR 擴增條件、引物濃度和樣品用量進行調整，選擇最適當的引物濃度、樣品濃度和 PCR 擴
增條件。
3.本產品使用前應在室溫充分融解，并用漩渦震蕩器充分混勻。
4.統一配液后分裝以減少加樣誤差，每次實驗應設置陰性對照。
5.禁止標記 PCR 反應管，避免外源性熒光信號干擾。
6.PCR 反應管中不能有氣泡，否則會產生非特異的熒光信號。若有氣泡，可先用手指將氣泡彈破，然后再低速離心消除。
7.實時熒光 PCR 儀器連續進行實驗時，最好間隔一小時以上再使用。
8.實時熒光 PCR 儀需經常校正和清潔載樣板板孔。
9.若使用Roch LightCyclerTM 熒光PCR儀，應將毛細管放在專門套管中，以便分裝反應體系和加入待檢樣品。前述操作
完畢應低速離心數秒再將毛細管垂直緩慢放入樣品架，以免折斷；若發生折斷，應小心取出，用專用小毛刷擦拭干凈后
方可進行擴增。
10.實驗室應嚴格分區，避免 PCR 產物污染。