血清替代品：XerumFreeXF205培養基添加物使用說明（四）

細胞的繼代

--吸取細胞培養基，用DPBS(無Ca++/Mg++)洗細胞一次。

--用足夠體積的Accutase^TM溶液浸沒細胞層并在37℃孵育5min。如必要可通過輕輕地拍打細胞培養器皿的側面分散細胞。

--加入完全培養基稀釋細胞消化溶液（至少加兩倍體積的Accutase^TM）

--轉移細胞懸浮液到離心管中，然后以300×g離心5min

--棄上清然后在完全培養基中通過輕輕地吸吐重懸細胞

--細胞計數

--以2000個細胞/cm²的密度接種細胞懸浮液到一個新的包被的培養板中或即用型Synthemax^TM培養皿中（參看上面“培養器皿表面的包被”）

--在37℃，5% CO₂的濕潤孵育器中孵育細胞

--當細胞融合達到近70%時盡快地進行繼代培養，一般情況下每周繼代兩次。

2.3 原代培養

原代細胞培養物存在于剛剛從活的組織或器官分離而來的生長的細胞。這些細胞代表著細胞培養世界的核心：到目前為止所有的細胞系都起始于原代培養。除了產生新的細胞系，原代培養代表著一個非常重要的工具，尤其在藥物發現和生產，再生醫學和基礎研究領域里。

從技術角度來看，在細胞培養過程中原代細胞培養仍然是最微妙的一部分。新分離的細胞沒有任何選擇壓力且高度保留著體內部分的特征。這就要滿足新分離細胞對營養和生理的要求。在理想地情況下，對于原代細胞的培養應盡可能地模仿體內的環境，比如細胞外空間。只在明確的細胞培養條件下，且對營養和細胞因子的供給完全地控制才能夠實現這一理想情況。

原代細胞培養有著非常不同的要求，取決于組織的來源。在無不明確的添加物比如牛血清或其衍生物的條件下，已經證明XerumFree^TM在不同的原代細胞培養中取得成功。然而，沒有一個通用的能滿足所有原代細胞類型培養的配方。

下面的指導方針分為兩部分：應用于所有細胞類型的常規建議和主要組織類型的具體要求。

2.3.1 常規建議

無論所用的是哪種細胞類型，如果選擇無血清條件下進行原代細胞培養，需按照以下幾點進行處理。

無血清貼壁因子

準備步驟--培養器皿表面的包被

在明確的培養條件下，用足夠的包被劑處理培養表面是至關重要的。通常細胞外基質（ECM）的制備較粗糙，比如小鼠肉瘤提取物（比如基質膠）或提取的膠原。然而，不明確的天然成分和動物源成分的存在顯示許多應用是有問題的。

如果不想培養基中含有的動物源成分造成任何問題，快速的解決方法可以考慮用已采用少量FBS過夜處理的細胞培養板。這個方法是方便經濟有效的，然而它將意味著從完全明確的培養環境的概念中后退一步。

今天可以用現成的重組的，明確的包被試劑盒，盡管是來源于纖連蛋白，層粘連蛋白，膠原蛋白，E-鈣粘蛋白，玻連蛋白等生物合成的信號肽，但能模仿ECM蛋白的貼壁性質。

無血清酶抑制劑

消化酶

開始一個原代培養主要有兩種方法：通過從組織塊中分離或酶解離而來的產物。在后一種方法中起始組織用蛋白水解酶或酶溶液消化，比如分散酶，膠原酶和胰蛋白酶。

接種細胞之前必須小心地中和/失活任何有蛋白水解活性的成分。尤其是使用胰酶時必須解決這個問題。

無血清的環境中使用標準胰酶制備可能會出現問題，因為血清中含有胰蛋白酶抑制劑。分散細胞之后，在無血清條件下胰酶活性必須被失活，可以用一個高效的胰酶抑制劑，比如大豆胰酶抑制劑。

作為胰酶的替代品，強烈建議使用Accutase^TM，因為其不需要被失活。這個重組的非哺乳動物來源的酶已經高效地應用于一系列原代細胞培養中，包括原代平滑肌細胞，原代人內皮細胞，原代雞神經細胞。

無血清蛋白的結合

抗生素的使用

像其它化合物一樣抗生素結合到血清的血漿蛋白上，尤其是白蛋白片段。因此，在無血清和白蛋白的條件下同樣的抗生素濃度將顯示出較高的生物活性，且增加的活性將對細胞生長造成有害影響。尤其是鏈霉素會干擾哺乳動物細胞蛋白合成水平。

如果無抗生素培養是不可行的，我們建議使用濃度為50mg/L的慶大霉素。

2.3.2. 針對細胞類型的具體建議

根據組織來源不同，原代細胞培養有不同的細胞培養要求。

在這個冊子里我們沒有具體描述原代細胞培養操作流程，因為不同的細胞類型之間是截然不同的。一般情況下我們建議用傳統的方法分離原代細胞，并且用5倍濃縮的XerumFree^TM代替血清。

這將滿足大多數細胞類型的營養需求，事實上，在哺乳動物細胞培養這個領域，營養需求稍有不同，更多地依賴于細胞類型，比如肝細胞需要更高的營養濃度。

不同類型的細胞之間對生長因子和激素的需求是不同的。

下面的表格列出了我們推薦用XerumFree^TM代替動物血清的細胞培養基制備。

關于指定的四種細胞類型，生長因子和激素的添加對于細胞發育和增殖是理想的。

2.3.3推薦的四種主要的原代細胞類型的細胞培養基的建立

*為了使細胞很好地貼壁和蔓延，我們強烈建議用CaCl₂(0.06 mM)

Nb. 不要濾滅XerumFree^TM。我們建議制備含有谷氨酰胺的基礎培養基，如果生長因子和激素需要濾滅，可以濾滅之后再添加XerumFree^TM。

Nb. XerumFree^TM是5倍濃縮的，因此所加的5倍濃縮液比通常所用的FBS體積低（比如10% FBS相當于2% XerumFree^TM）。

Nb. 對于其它的原代培養細胞類型，可以聯系TNC Bio，關于建議生長因子和激素的添加量，我們將盡可能地提供最大支持。