轉基因食品問題,一直以來都是充滿爭議的話題;如何科學正確地檢測轉基因產品,成了政府檢測機構及相關工作者高度關心的問題。
轉基因農產品的檢測,就是檢測農產品中是否含有外源基因,即檢測啟動子、終止子、標記基因、目的基因、外源基因轉錄產物的豐度等。就方法而言,又分為基因水平的檢測和蛋白水平的檢測。
轉基因產品核酸水平檢測的流程如下:
第一步:樣本前處理
稱取一定質量的樣品,在研缽中研磨或用自動組織勻漿儀處理,得到樣品粉末,同時使組織細胞破壁、釋放出核酸。
第二步:DNA提取純化
可以采用商業化DNA提取試劑盒,手動或利用自動核酸提取純化系統制備DNA模板,用于后續的PCR分析。
第三步:內源基因的檢測
對物種內源基因的PCR檢測,主要用于驗證DNA模板的提取質量;
可采用普通PCR方法將目標內源基因擴增后,通過瓊脂糖凝膠電泳分離,利用凝膠成像設備觀察分析是否有出現預期大小的擴增條帶;
也可通過實時熒光定量PCR方法直接檢測目標內源基因的有無。
檢測結果陽性表明從樣品中提取出適宜進行檢測的DNA,可以進行外源基因檢測,否則應重新進行DNA提取和純化。
第四步:篩選基因檢測與品系鑒定檢測
對植物中轉基因成分的檢測,先篩選檢測CaMV 35S、NOS、NPTII、PAT、BAR基因(啟動子、終止子等等),確定是否含有外源基因;篩選結果陰性則直接報告結果;
若篩選結果陽性,則需要進一步鑒定檢測MON810、Bt11、Bt176、T14/T25、CBH351、GA21、TC1507、MON863、NK603、Bt10(結構基因)的結構特異性基因或品系特異性基因以確定是何種轉基因品系。
這兩個步驟均可通過普通PCR或者實時熒光定量PCR方法完成。
第五步:確證實驗
如果采用普通PCR方法檢測篩選基因與結構特異性基因或品系特異性基因結果為陽性,則需要通過采用實時熒光PCR方法進行結果確證實驗。
第六步:結果判斷與計算
待測樣品外源基因檢測Ct值≥40,內源基因檢測Ct值≤24,對照正常,則可判定該樣品未檢出XXX基因; 待測樣品外源基因檢測Ct值≤36,內源基因檢測Ct值≤24,對照結果正常,則可判定該樣品檢出XXX基因; 待測樣品外源基因檢測Ct值在36-40之間,應重做實時熒光PCR擴增。 定量計算:利用陽性標準品與基因檢測Ct值,可以分別計算出外源基因與內源基因序列拷貝數,按照下列公式對轉基因成分進行定量計算: |
第七步:結果表述
定性結果表述:
對于X物種,未檢出轉基因成分;
對于X物種,檢出轉基因成分,(可進一步報告)該樣品中含有XX轉基因品系。
定量結果表述:
未檢出轉基因成分,定量方法檢測限為X%;
樣品中XX轉基因成分低于本定量方法檢測限(X%);
樣品中所含XX轉基因成分為X%。