通過2△△CT方法,利用實時定量PCR技術分析相對基...（一）

通過2 -△△CT 方法,利用實時定量PCR技術分析相對基因表達差異

摘要:

現在最常用的兩種分析實時定量 PCR 實驗數據的方法是絕對定量和相對定量。絕對定量通過標準曲線計算起始模板的拷貝數；相對定量方法則是比較經過處理的樣品和未經處理的樣品目標轉錄本之間的 表達差異。 2 - △△ CT 方法是實時定量 PCR 實驗中分析基因表達相對變化的一種簡便方法，即相對定量的一種簡便方法。本文介紹了該方法的推導，假設及其應用。另外，在本文中我們還介紹了兩種 2 - △△ CT 衍生方法的推導和應用，它們在實時定量 PCR 數據分析中可能會被用到。

簡述:

反轉錄 PCR （ RT-PCR ）是基因表達定量非常有用的一種方法（ 1 － 3 ）。實時 PCR 技術和 RT-PCR 的結合產生了反轉錄定量 PCR 技術（ 4 ， 5 ）。實時定量 PCR 的數據分析方法有兩種：絕對定量和相對定量。絕對定量一般通過定量標準曲線來確定我們所感興趣的轉錄本的拷貝數；相對定量方法則是用來確定經過不同處理的 樣品目標轉錄本之間的表達差異或是目標轉錄本在不同時相的表達差異。

絕對定量通常在需要確定轉錄本絕對拷貝數的條件下使用。通過實時 PCR 進行絕對定量已有多篇報道（ 6 － 9 ），包括已發表的兩篇研究論文（ 10 ， 11 ）。在有些情況下，并不需要對轉錄本進行絕對定量，只需要給出相對基因表達差異即可。顯然，我們說 X 基因在經過某種處理後表達量增加 2.5 倍比說該基因的表達從 1000 拷貝 / 細胞增加到 2500 拷貝 / 細胞更加直觀。

用實時 PCR 對基因表達進行相對定量分析需要特殊的公式、假設以及對這些假設的驗證。 2 - △△ CT 方法可用于定量 PCR 實驗來計算基因表達的相對變化： 2 - △△ CT 公式的推導 , 以及實驗設計，有效性評估在 Applied Biosystems User Bulletin No.2(P/N4303859) 中有介紹。用 2 - △△ CT 方法分析基因表達數據在文獻中也有報道 (5, 6) 。本文介紹了該方法的推導、假設以及應用。另外，本文還介紹了 2 - △△ CT 兩種衍生方法的推導和應用，它們在實時定量 PCR 數據分析中都可能被用到。

2-△△ CT 方法

2-△△ CT 方法的推導

PCR 指數擴增的公式是：

這里，Xn 是第 n 個循環後目標分子數，X0 是初始目標分子數，Ex 是目標分子擴增效率，n 是循環數，C T 代表目標擴增產物達到設定閾值所經歷的循環數。

因此：

X T 是目標分子達到設定的閾值時的分子數。C T,X 是目標分子擴增達到閾值時的循環數。Kx 是一個常數。

對于內參反應而言，也有同樣的公式：

用XT 除以RT 得到：

對于使用 Taqman 探針的實時擴增而言， XT 和 RT 的值由一系列因素決定：包括探針所帶的熒光報導基團、探針序列對探針熒光特性的影響、探針的水解效率和純度以及熒光閾值的設定。因此常數K 并不一定等于1 。

假設目標序列與內參序列擴增效率相同：

或：

XN 代表經過均一化處理過的初始目標分子量；△CT表示目標基因和內標基因CT值的差異（CT,X－CT,R ）整理上式得：

最后用任一樣本q 的XN 除以參照因子（calibrator, cb）的XN得到：

在這里

對于一個少于150bp 的擴增片斷而言，如果 Mg2+ 濃度、引物都進行了適當的優化，擴增效率接近于1 。因此目標序列的量通過內均一化處理之后相對于參照因子而言就是