實時熒光定量PCR（Real-time PCR，QPCR，熒光定量）分類以及實驗步驟介紹
實時熒光定量PCR（Real-time PCR，QPCR，熒光定量）技術（Real-time quantitative PCR），是指在（QPCR，熒光定量）反應體系中加入熒光基因，利用熒光信號積累實時監測整個（QPCR，熒光定量）PCR進程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。
實時熒光定量PCR技術于1996年由美國AppliedBiosystems公司推出，由于該技術不僅實現了PCR從定性到定量的飛躍，而且與常規PCR相比，實時熒光定量PCR（Real-time PCR，QPCR，熒光定量）它具有特異性更強、靈敏度高、重復性好、定量準確、速度快、全封閉反應、有效解決PCR污染問題、自動化程度高等特點，已成為國際公認的核酸分子定量的標準方法，目前（Real-time PCR，QPCR，熒光定量）在基因表達研究和臨床疾病檢測等領域已得到廣泛應用（如轉基因動植物檢測、RNAi基因失活率檢測、病原微生物或病毒含量檢測、基因差異表達、基因分型）。本公司用Sybrgreen法或者Taqman法Real-time PCR，QPCR，熒光定量）對DNA/RNA 進行實時熒光定量PCR（Real-time PCR） 的定量測定或型的鑒定。
實時熒光定量PCR（Real-time PCR，QPCR，熒光定量）分類：
☆TaqMan熒光探針（Real-time PCR，QPCR，熒光定量）
PCR擴增時在加入一對引物的同時加入一個特異性的熒光探針，該探針為一寡核苷酸，兩端分別標記一個報告熒光基團和一個淬滅熒光基團。探針完整時，報告基團發射的熒光信號被淬滅基團吸收；PCR擴增時，Taq酶的5‘-3‘外切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離，從而熒光監測系統可接收到熒光信號，即每擴增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，實現了熒光信號的累積與PCR產物形成完全同步。
☆SYBR Green熒光染料法：Real-time PCR|QPCR
SYBR Green是一種DNA結合染料，能非特異地摻入到雙鏈DNA中去。在游離狀態下，它不發出熒光，但一旦結合到雙鏈DNA中以后，便可以發出熒光。在Real-time PCR|QPCR實驗中它的最大優點就是可以與任意引物、模板相配合，用于任意反應體系中。從經濟角度考慮，它也比其它的探針的Real-time PCR|QPCR價格要便宜得多。但由于它能與所有的雙鏈DNA結合，所以一旦反應體系中出現非特異擴增，那它就會影響到定量結果的可靠性與重復性。要避免這種不利因素，可以通過選擇良好的引物并優化反應條件以消除非特異性影響。
●主要實驗步驟如下：
實時熒光定量PCR（Real-time PCR）是由三個步驟組成:
反轉錄:依賴反轉錄酶將RNA反轉錄成cDNDA;
2.擴增:用PCR的方法擴增cDNA;
3.檢測:實時檢測和定量擴增的產物.
實時熒光定量PCR|Real-time PCR|QPCR中的一些術語
1 CT值：熒光信號有統計意義顯著增長(即穿過閾值線)時的循環次數，或者說是從基線到指數增長的拐點所對應的循環次數。
2 閾值：閾值的默認設置是3-15個循環的熒光信號的標準偏差的10倍。
3 CT值與起始模板的量成線性關系。