使用UPLC／MS／MS分析血清中的25羥基維生素D（一）

簡介
臨床研究表明：維生素D缺乏癥在世界許多地區的成人和兒童中非常普遍。除了眾所周知的影響(例如與鈣吸收障礙相關的佝僂病、骨質疏松癥和骨軟化癥)外，現在越來越多的證據表明維生素D缺乏癥還會增加罹患某些癌癥的風險，并對許多其它疾病有一定的影響^1,2。維生素D具有兩種存在形式，一種是皮膚暴露于日光下所產生的維生素D₃(D3) ，另一種則是存在于多種補品中的植物衍生物—維生素D₂(D2)。維生素D在肝臟中代謝形成25-羥基維生素D[25OHD]，后者在腎臟中進一步代謝形成活性代謝物1,25-二羥基維生素D。25OHD的水平被認為是評價體內維生素D水平的最佳臨床指標³。維生素D水平的評估對于維生素D缺乏癥的診斷和補充治療的監測非常重要。最近，相對于競爭性結合檢測、免疫檢測和HPLC法等其它方法，利用LC/MS/MS方法定量分析25OHD2和25OHD3在提高檢測質量和降低成本方面，更加受到人們的青睞。免疫檢測的主要問題是無法區分25OHD2和25OHD3，還需依靠抗體與25OHD2的交叉反應才能測定25OHD的總濃度 。如果該交叉反應低于100%，那么D2治療可能無法得到準確監測⁴。

圖1. 沃特世ACQUITY UPLC/TQD的系統配置

實驗
將Waters? ACQUITY? 串聯四極桿檢測器(TQD)與ACQUITY UPLC?聯用以進行各項分析。完整的系統配置如圖1所示。儀器通過MassLynx? 4.1軟件在電噴霧正離子模式下運行，并采用QuanLynx^TM應用軟件自動進行數據處理。對錐孔電壓進行優化，使得進入離子源的母離子的豐度最大化，并通過第一級四極桿選擇相應的母離子進入碰撞池。利用氬氣和碰撞能量促使碰撞誘導解離，生成特征性產物離子。利用此方法建立特異的多重反應監測(MRM) ，實驗如表1所示。

LC條件
LC系統： Waters ACQUITY UPLC系統
色譜柱： ACQUITY UPLC BEH C₈, 2.1 x 50mm, 1.7μm
柱溫：   45 ?C
流速：   400μL/min
流動相A： 2 mM醋酸銨+0.1%甲酸的水溶液
流動相B： 2 mM醋酸銨+0.1%甲酸的甲醇溶液
梯度： 流動相B在73%保持2 min，在1.5 min內從73%增加至98% 

MS條件
MS系統： Waters ACQUITY TQD
電離模式： ESI+ 
毛細管電壓： 2.5kV
錐孔電壓： 24V
脫溶劑氣溫度：400?C  
脫溶劑氣流量：900L/h
源溫度： 120?C
碰撞氣流速: 7.10 x 10^-3mbar