奶及奶制品中黃曲霉素M1檢測

一、背景介紹

黃曲霉毒素M1 （Aflatoxin M1）屬于黃曲霉毒素一類結構相似的化合物中的一種，在濕熱地區食品和飼料中出現黃曲霉毒素的機率最高。物理化學性質相當穩定，不被巴氏消毒法破壞。哺乳類動物攝入被黃曲霉毒素B1污染的飼料或食品后，通過羥基化作用轉化成黃曲霉毒素M1。黃曲霉毒素M1危害主要表現在致癌性和致突變性，對人及動物肝臟組織有破壞作用，可導致肝癌甚至死亡。

目前來講，Aflatoxin M1的檢測方法有高效液相色譜法(HPLC)，酶聯免疫檢測法等。液相色譜法可以精確的檢測奶制品中黃曲霉毒素的微小含量。而使用黃曲霉毒素M1 ELISA試劑盒則能夠快速而準確的分析樣品中黃曲霉毒素M1殘留。

Pribolab(普瑞邦)作為專業從事霉菌毒素檢測技術與產品服務的主要供應商之一，整合了原北京泰樂祺檢測應用實驗室，更加專注于霉菌毒素檢測產品和技術解決方案的服務,以期快速提出解決方案。針對幾年來牛奶及其制品中不斷出現的黃曲霉毒素M1超標問題，建立了一套完整的解決方案。

二、參考標準：根據國標《GB 5413.37—2010》食品安全國家標準乳和乳制品中黃曲霉毒素M1 的測定。

（一）免疫親和柱-高效液相色譜法：符合GB 5413.37-2010國標方法

1. 所需設備和耗材　　

高效液相色譜儀

色譜柱：真菌毒素專用色譜柱（PRC-18，Pribolab）。

免疫親和柱：PriboFast?黃曲霉毒素M1免疫親和柱(IAC-012-3, Pribolab，25支/盒，快速過柱型，適用于粘稠樣本：如生鮮乳、酸奶等,有效解決過柱易堵問題)。

高速均質器：不銹鋼耐腐蝕,轉速達到22000rpm 以上(EQ-WR-1L，Pribolab)。

玻璃纖維濾紙：PriboFast?玻璃纖維濾紙（GMF/A-110，Pribolab）

PriboFast?八位泵流操作架（Pribolab，用于控制免疫親和柱過柱流速）

標準品：Aflatoxin M1（固體標準品MSS1007  100ug或0.5μg/ml Aflatoxin M1 液體標準品，Pribolab)

2. 樣品前處理:普瑞邦針對生鮮乳、干酪、奶油等提供不同的處理方案(詳細方案請聯系Pribolab中國:400-688-5349，普瑞邦開發了針對多種奶品基質提供優化的前處理方案)

3. 免疫親和柱凈化: PriboFast?黃曲霉毒素M1免疫親和柱(IAC-012-3, Pribolab)

富集:提取液以2-3mL/min流速通過免疫親和柱，直至2-3mL空氣通過柱體；

洗滌: 10mL 0.1%的吐溫/PBS清洗，以10mL水洗柱子2次，并使2-3mL空氣通過柱體。

洗脫：加入1.0mL色譜級甲醇洗脫,孵育30秒以上,以流速為1-2mL/min過柱，收集全部洗脫液供檢測用。

4. 高效液相色譜分析 

色譜柱：C18，長25 cm，內徑4.6 mm；

流動相：25 %乙腈水溶液(10.2.1)；

流速：1 mL/min。

（二）酶聯免疫法

1. 方法原理

采用直接競爭酶聯免疫法，在微孔板上預包被黃曲霉毒素M1抗原，加入樣本（或黃曲霉毒素M1標準品溶液）及辣根過氧化物酶標記的黃曲霉毒素M1抗體。樣本或標準品溶液中的抗原與預包被在板孔上的抗原競爭結合酶標抗體。未結合的酶標抗體在洗滌時被除去。再加入TMB顯色液，讀取吸光值。樣品吸光值與其所含黃曲霉毒素M1量成負相關，與標準曲線比較即可得出樣品中黃曲霉毒素M1的含量。

2. 試劑和材料：酶聯免疫試劑盒（PriboFastR黃曲霉毒素M1 試劑盒 EKT-012，Pribolab）

3. 樣本前處理：牛奶：離心取下層待測。奶粉：復溶離心取下層待測。

4. 檢測步驟

4.1 免疫反應30min；洗板5次；顯色反應30min；終止反應，酶標儀讀OD值。

5. 分析結果的表述

用酶標儀判讀結果。

（三）免疫金標快速檢測法

1. 方法原理

黃曲霉毒素M1(AFM1)快速檢測條應用了競爭抑制免疫層析的原理，樣本中的黃曲霉毒素M1在酶標孔中與膠體金標記的特異性抗黃曲霉毒素M1單克隆抗體結合，抑制了抗體和NC膜檢測線上AFM1－BSA偶聯物的結合。如果樣本中黃曲霉素M1含量大于0.5 ug/L，檢測線不顯顏色，結果為陽性；反之，檢測線顯紅色，結果為陰性。

2. 試劑和材料

膠體金檢測試紙：PriboStripTM黃曲霉毒素M1免疫金標快速檢測條（PR-012，Pribolab）

3. 分析步驟：奶粉復溶后檢測；液態奶直接檢測。吸取奶液滴加到加樣孔中，8-15分鐘讀取結果。在C線顯色的情況下：T 線顯色比C線深或一樣深是陰性。T 線顯色比C線淺，或無顯色是陽性結果。