ELISA的操作要點（二）

六、顯色和比色

（一） 顯色

顯色是ELISA中的最后一步溫育反應，此時酶催化無色的底物生成有色的產物。反應的溫度和時間仍是影響顯色的因素。在一定時間內，陰性孔可保持無色，而陽性孔則隨時間的延長而呈色加強。適當提高溫度有助于加速顯色進行。在定量測定中，加入底物后的反應溫度和時間應按規定力求準確。定性測定的顯色可在室溫進行，時間一般不需要嚴格控制，有時可根據陽性對照孔和陰性對照孔的顯色情況適當縮短或延長反應時間，及時判斷。

OPD底物顯色一般在室外溫或37℃反應20-30分鐘后即不再加深，再延長反應時間，可使本底值增高。OPD底物液受光照會自行變色，顯色反應應避光進行，顯色反應結束時加入終止液終止反應。OPD產物用硫酸終止后，顯色由橙黃色轉向棕黃色。

TMB受光照的影響不大，可在室溫中置于操作臺上，邊反應觀察結果。但為保證實驗結果的穩定性，宜在規定的適當時間閱讀結果。TMB經HRP作用后，約40分鐘顯色達頂峰，隨即逐漸減弱，至2小時后即可完全消退至無色。TMB的終止液有多種，疊氮鈉和十二烷基硫酸鈉（SDS）等酶抑制劑均可使反應終止。這類終止劑尚能使藍色維持較長時間（12-24小時）不褪，是目視判斷的良好終止劑。此外，各類酸性終止液則會使藍色轉變成黃色，此時可用特定的波長（450nm）測讀吸光值。

（二）比色

比色前應先用潔凈的吸水紙拭干板底附著的液體，然后將板正確放入酶標比色儀的比色架中。以軟板為載體的試驗，需先將板置于標準96孔的座架中，才可進行比色。最好在加底物液顯色前，先將軟板邊緣剪凈，這樣，此板就可完全平妥坐入座架中。 比色時應先以蒸餾水校零點，測讀底物孔（未經任何反應僅加底物液的孔）和空白孔（以生理鹽水或稀釋液代替標本作全過程的孔），以記錄本次試驗的試劑狀況。其后可用空白孔以蒸餾水校零點，以上各孔的吸光度需減去空白孔的吸光度，然后進行計算。

比色結果的表達以往通用光密度（oplical density，OD），現按規定用吸光度（absorbence，A），兩者含義相同。通常的表示方法是，將吸收波長寫于A字母的右下角，如OPD的吸收波長為492nm，表示方法為"A492nm"或"OD492nm"。

（三） 酶標儀

酶標比色儀簡稱酶標儀，通常指專用于測讀ELISA結果吸光度的光度計。針對固相載體形式的不同，各有特制的適用于板、珠和小試管的設計。許多試劑公司配套供應酶標儀。酶標儀的主要性能指標有：測讀速度、讀數的準確性、重復性、精確度和可測范圍、線性等等。優良的酶標儀的讀數一般可精確到0.001，準確性為±1%，重復性達0.5%。舉例說，若某孔測得的A值為1.083，則該孔相對于空氣的真實A值應為1.083±0.01（1.073~1.093），重復測定數次，其A值均應1.083±0.05（1.078~1.088）在之間。酶標儀的可測范圍視各酶標儀的性能而不同。普通的酶標儀在0.000~2.000，新型號的酶標

儀上限拓寬達2.900，甚至更高。超出可測上限的A值常以"*"或"over"或其它符號表示。應注意可測范圍與線性范圍的不同，線性范圍常小于可測范圍，比如某一酶標儀的可測范圍為0.000~2.900，而其線性范圍僅0.000~2.000，這在定量ELISA中制作標準曲線時應予注意。

酶標儀不應安置在陽光或強光照射下，操作時室溫宜在15~30℃，使用前先預熱儀器15-30分鐘，測讀結果更穩定。

測讀A值時，要選用產物的敏感吸收峰，如OPD用492nm波長。有的酶標儀可用雙波長式測讀，即每孔先后測讀兩次，第一次在最適波長（W1），第二次在不敏感波長（W2），兩次測定間不移動ELISA板的位置。例如OPD用492nm為W1，630nm為W2，最終測得的A值為兩者之差（W1-W2）。雙波長式測讀可減少由容器上的劃痕或指印等造成的光干擾。

各種酶標儀性能有所不同，使用中應詳細新聞記者說明書。

七、 結果判斷

1、 定性測定

定性測定的結果判斷是對受檢標本中是否含有待測抗原或抗體作出"有"或"無"的簡單回答，分別用"陽性"、"陰性"表示。"陽性"表示該標本在該測定系統中有反應。"陰性"則為無反應。用定性判斷法也可得到半定量結果，即用滴度來表示反應的強度，其實質仍是一個定性試驗。在這種半定量測定中，將標本作一系列稀釋后進行試驗，呈陽性反應的最高稀釋度即為滴度。根據滴度的高低，可以判斷標本反應性的強弱，這比觀察不稀釋標本呈色的深淺判斷為強陽性、弱陽性更具定量意義。

在間接法和夾心法ELSIA中，陽性孔呈色深于陰性孔。在競爭法ELISA中則相反，陰性孔呈色深于陽性孔。兩類反應的結果判斷方法不同，分述于下。

（1） 間接法和夾心法

這類反應的定性結果可以用肉眼判斷。目視標本也無色或近于無色者判為陰性，顯色清晰者為陽性。但在ELSIA中，正常人血清反應后常可出現呈色的本底，此本底的深淺因試劑的組成和實驗的條件不同而異，因此實驗中必須加測陰性對照。陰性對照的組成應為不含受檢物的正常血清或類似物（見3.6）。在用肉眼判斷結果時，更宜用顯色深于陰性對照作為標本陽性的指標。

目視法簡捷明了，但頗具主觀性。在條件許可下，應該用比色計測定吸光值，這樣可以得到客觀的數據。先讀出標本（sample，S）、陽性對照（P）、和陰性對照（N）的吸光值，然后進行計算。計算方法有多種，大致可分為陽性判定值法和標本與陰性對照比值法兩類。

a． 陽性判定值

陽性判定值（cut-off value）一般為陰性對照A值加上一個特定的常數，以此作為判斷結果陽性或陰性的標準。

用此法判斷結果要求實驗條件十分恒定，試劑的制備必須標準化，陽性和陰性的對照品應符合一定的規格，須配用精密的儀器，并嚴格按規定操作。陽性判定值公式中的常數是在這特定的系統中通過對大量標本的實驗檢測而得到的。現舉某種檢測HBsAg的試劑盒為例。試劑盒中的陰性對照品為不含HBsAg的復鈣人血漿，陽性對照品HBsAg的含量標明為P=9±2ng/ml.每次試驗設2個陽性對照和3個陰性對照。測得A值后，先計算陰性對照A值的平均數（NCX）和陽性對照A值的平均數（PCX），兩個平均數的差（P-N）必須大于一個特定的數值（例0.400），試驗才有效。3個陰性對照A值均應≥0.5×NCX，并≤1.5×NCX，如其中之一超出此范圍，則棄去，而已另兩個陰性對照重新計算NCX；如有兩個陰性對照A值超出以上范圍，則該次實驗無效。陽性判定值按下式計算： 陽性判定值=NCX+0.05　標本A值＞陽性判定值的為陽性，小于陽性判定值的為陰性。應注意的是，式中0.05為該試劑盒的常數，只適合于該特定條件下，而不是對各種試劑均可通用。

根據以上敘述可以看出，在這種方法中陰性對照和陽性對照也起到試驗的質控作用，試劑變質和操作不當均會產生"試驗無效"的后果。

b.標本/陰性對照比值

在實驗條件（包括試劑）較難保證恒定的情況下，這種判斷法較為合適。在得出標本（S）和陰性對照（N）的A值后，計算S/N值。也有寫作P/N的，這里的P不代表陽性(positive)，而是病人（patient）的縮寫，不應誤解。為避免混淆，更宜用S/N表示。在早期的間接法ELISA中，有些作者定出S/N為陽性標準，現多為各種測定所沿用。實際上每一測定系統應該用實驗求出各自的S/N的閾值。更應注意的是，N所代表的陰性對照是不含受檢物質的人血清。有的試劑盒中所設陰性對照為不含蛋白質或蛋白質含量較底的緩沖液，以致反應后產生的本底可能較正常人血清的本底低得多。因此，這類試劑盒規，如N<0.05（或其他數值），則按0.05計算，否則將出現假陽性結果。

（2）競爭法

在競爭法ELISA中，陰性孔呈色深于陽性孔。陰性呈色的強度取決于反應中酶結合物的濃度和加入競爭抑制物的量，一般調節陰性對照的吸光度在1.0-1.5之間，此時反應最為敏感。

競爭法ELISA不易用自視判斷結果，因肉眼很難辨別弱陽性反應與陰性對照的顯色差異，一般均用比色計測定，讀出S、P和N的吸光值。計算方法主要也有兩種，即陽性判定值法和抑制率法。

a. 陽性判定值法

與間接法和夾心法中的陽性判定值法基本相同，但在計算公式中引入陽性對照A值，現舉某種檢測抗HBc的試劑盒為例。試劑盒中的陰性對照為不含抗HBc的復鈣人血漿，陽性對照中抗HBc含量為125±100u/ml.每次試驗設2個陽性對照和3個陰性對照。測得A值后，先計算陰性對照A值的平均值（NCX）和陽性對照A值的平均數（PCX），兩個平均數的差（N-P）必須大于一個特定的數值（例如0.300），試驗才有效。3個陰性對照A值均應小于2.000，而且應≥0.5×NCX并≤1.5×NCX，如其中之一超出此范圍，則棄去，而以另2個陰性對照重新計算×NCX；如有2個陰性對照A超出以上范圍，則該次實驗無效。陽性判定值按下式計算：

陰性判定值=0.4×NCX+0.6×PCX

標本A值≤陽性判定值的反應為陽性，A＞陽性判定值的反應為陰性。

b. 抑制率法

抑制率表示標本在競爭結合中標本對陰性反應顯色的抑制程度，按下式計算：

抑制率（%）= （陰性對照A值-標本A值）×100%/陰性對照A值

一般規定抑制率≥50%為陽性，＜50%為陰性。

2、定量測定

ELSIA操作步驟復雜，影響反應因素較多，特別是固相載體的包被難達到各個體之間的一致，因此在定量測定中，每批測試均須用一系列不同濃度的參考標準品在相同的條件下制作標準曲線。測定大分子量物質的夾心法ELISA，標準曲線的范圍一般較寬，曲線最高點的吸光度可接近2.0，繪制時常用半對數紙，以檢測物的濃度為橫坐標，以吸光度為縱坐標，將各濃度的值逐點連接，所得曲線一般呈S形，其頭、尾部曲線趨于平坦，中央較呈直線的部分是最理想的檢測區域。甲胎蛋白質ELISA測定的標準曲線示例見圖4-1。

測定小分子量物質常用競爭法，其標準曲線中吸光度與受檢物質的濃度呈負相關。標準曲線的形狀因試劑盒所用模式的差別而略有不同。ELISA測定的標準曲線示例見圖4-2.注意圖中橫坐標為對數關系，這更有利于測定系統的表達。

新型酶標儀一般帶有自動軟件可進行定量分析。