差示反轉錄PCR也稱為mRNA差異顯示技術，它是將mRNA反轉錄技術與PCR技術二者相互結合發展起來的一種RNA指紋圖譜技術，具有簡便、靈敏、RNA用量少、效率高、可同時檢測兩種或兩種以上經不同處理或處于不同發育階段的樣品，該方法自問世以來已被廣泛用于差異表達基因的克隆鑒定研究中。
| 實驗方法原理 | 幾乎所有的真核基因mRNA分子的3’-末端，都帶有一個多聚的腺苷酸結構，即通常所說的poly(A)尾巴。因此，在RNA聚合酶的作用下，可按mRNA為模板，以oligo(dT)為引物合成出cDNA拷貝。根據mRNA分子3’-末端序列末端結構的分析可以看到，在這段poly(A)序列起點堿基之前的一個堿基，除了為A的情況之外，只能有C、G、T三種可能。根據這種序列結構特征，P.Peng等人設計合成三中不同的下游引物，它由11個或12個連續的脫氧核苷酸加上一個3’-末端錨定脫氧核苷酸組成，用5’-T11G、5’-T11C、5’-T11A表示，這樣每一種此類人工合成的寡核苷酸引物都將能夠把總mRNA群體的1/3分子反轉錄成mRNA-cDNA雜交分子。于是，采用這三種引物，可以將整個mRNA群體在cDNA水平上分成三個亞群體。然后用一個上游的隨機引物和與反轉錄時相同的oligo(dT)引物對這個cDNA亞群體進行PCR擴增，因為這個上游的引物將隨機結合在cDNA上 ,因此來自不同mRNA的擴增產物的大小是不同的，可以在測序膠上明顯分辨開來，從而篩選出不同樣品間基因差異表達的DNA片段。 |
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| 實驗材料 | |
| 試劑、試劑盒 | 丙烯酰胺 甲叉丙烯酰胺 SuperscriptTMⅡ試劑 檸檬酸鈉 Taq DNA聚合酶 dNTPs 十二烷基肌氨酸鈉 巰基乙醇 RNAimage試劑盒 異硫氰酸胍 焦碳酸二乙酯 |
| 儀器、耗材 | |
| 實驗步驟 | 一、實驗材料
1. 紅豆杉細胞
未經MJ誘導處理的A和經MJ誘導處理的B紅豆杉細胞。
2. 寡核苷酸引物
（1）3’錨定引物： ①H-T11A(2uM)： 5’-AAGCTTTTTTTTTTTA-3’ ②H-T11C(2uM)： 5’-AAGCTTTTTTTTTTTC-3’ ③H-T11G(2uM)： 5’-AAGCTTTTTTTTTTTG-3’
（2）5’ 隨機引物：
Kit引物： ①H-AP1(2uM)： 5’-AAGCTTGATTGCC-3’ ②H-AP2(2uM)： 5’-AAGCTTCGACTGT-3’ ③H-AP3(2uM)： 5’-AAGCTTTGGTCAG-3’ ④H-AP4(2uM)： 5’-AAGCTTCTCAACG-3’ ⑤H-AP5(2uM)： 5’-AAGCTTAGTAGGC-3’ ⑥H-AP6(2uM)： 5’-AAGCTTGCACCAT-3’ ⑦H-AP7(2uM)： 5’-AAGCTTAACGAGG-3’ ⑧H-AP8(2uM)： 5’-AAGCTTTTACCGC-3 |
mRNA差異顯示法
熒光標記法
