與直接原位PCR所不同的是，靶基因在擴增時不進行標記基團的摻入，而是標記一段與擴增片段互補的探針，在擴增結束后，應用此探針進行原位雜交。因此，此處主要介紹原位雜交，其余方法同原位PCR。
一、預雜交
1. 試劑與配制
2×SSC
50%去離子甲酰胺：用4×SSC配制（v/v）
預雜交液：2×SSC，5%硫酸葡聚糖，50%甲酰胺，0.2%脫脂奶粉
2. 操作方法
① 在進行完原位PCR擴增后，用2×SSC預浸經乙醇脫水、空氣干燥的玻片，并簡洗15min；
② 用50%去離子甲酰胺37℃孵育15min；
③加預雜交液20μl/片，在雜交溫度下孵育30min～2hr。
二、雜交
1. 試劑與配制
雜交液：50%去離子甲酰胺，5×SSC，10%硫酸葡聚糖，5×Denhardt’s 液，2%SDS，10mg/ml變性的鮭魚精DNA
2. 操作方法
① 棄預雜交液，加雜交液（含0.2～5μg/ml探針）10～20μl/片，覆蓋經硅化的蓋玻片，石蠟膜封片或橡皮泥封片；
② 玻片置于濕盒中，42℃雜交12～18hr（過夜，但不能超過24hr）。
2. 注意事項
① 如果檢測mRNA，雙鏈探針應變性處理，方法是95～100℃加熱10min后迅速置于冰中驟冷；
② 以單鏈探針檢測DNA時，DNA也需變性處理，將玻片置于70～80℃變性液（70%去離子甲酰胺，即甲酰胺/2×SSC，v/v）中10min；
③ 用雙鏈探針檢測DNA時，可按上述方法變性處理。
三、雜交后處理
1. 試劑與配制
2×SSC
Rnase（20μg/ml）
50%去離子甲酰胺
10mmol/L DTT
2. 操作方法
① 雜交完畢，用2×SSC浸泡玻片數分鐘，輕輕移去蓋玻片，再用2×SSC洗玻片1～2min；
② 2×SSC（含20μg/ml RNase，適宜RNA探針，DNA探針可省略此步）中洗片30min，37℃；
③ 2×SSC/50%去離子甲酰胺，42℃×10min；
④1×SSC/50%去離子甲酰胺，37℃×30min，2次；
⑤ 4×SSC/10mmol/L DTT洗1hr；
⑥ 0.1×SSC洗2次，每次37℃×30min；
⑦ PBS中洗10min，即可進行顯色，方法同上。