基因樣品

dNTP PCR混合液

PCR儀

1.  PCR混合液的制備

（1）Taq buffer（10×） 180 ul

（2）dNTP（2.5 mM） 20~25 ul

（3）Primer Forward（引物濃度在10 Pmol） 5 ul

（4）Primer Reverse（引物濃度在10 Pmol） 5 ul

（5）ddH₂O 147 ul

（6）Taq（2 U/ul） 12~15 ul

2.  常溫下隨機挑選轉化板上的轉化子，用滅菌的牙簽或槍頭挑取單個菌落（強調單個，不能是雙克隆），在LB瓊脂糖平板上輕點，做一拷貝。

3.  然后將沾有菌體的牙簽或槍頭置于相應的裝有PCR管中或者96空pcr反應板（管子做好記號，如平板上點的是1#，則管子上也標1#，以便篩選到克隆后的擴到培養）。

4.  挑好單克隆菌落后將之前配制好的PCR混合液加入體系是30 ul。

5.  將混有菌體的PCR混合物置于PCR儀中，按常規條件擴增。

6.  將擴增出來的反應液中加入溴酚藍或是其他染料，電泳檢測是否得到目的片斷。如有則為陽性克隆。

7.  將已經接種有菌落的平板置37℃培養箱培養過夜，使菌落擴增。

8.  次日挑選陽性克隆做進一步篩選或培養。步驟2也可以不點板，直接接種搖菌，如果早上做PCR的話，下午就可以提質粒，得到重組載體。

1.  設計引物很關鍵。一般如果是定向克隆，用載體上的通用引物即可；如pET系列可用T7通用引物。如果是非定向克隆（如單酶切或平末端連接），一條引物用載體，一條引物用目的基因上的，這樣就可以比較方便的鑒定了，而且錯誤概率很低。PCR條件的選擇接近最佳，同時挑取的菌體不宜太多，否則會有非特異性擴增。

2.  使用的引物濃度不能太高，濃度過高會導致非特異性擴增，反應的循環數也不能太多，一般不超過25個。同時因為擴增的片段的GC含量問題，有的GC含量很低，有的又很高，導致菌落PCR不容易擴增出目的條帶，在此建議在設置PCR程序時以高GC的溫度為上限，每一循環降0.2度左右。