結果與討論
之前已證明混合模式SPE是生物分析中最常選擇的一類樣品制備方法，這依賴于其分離分析物與內源性干擾物的雙正交保留機制。因此，混合模式SPE是本次實驗的首選。選用混合模式的弱陽離子交換劑基于以下兩個方面的原因：分析物呈堿性，需要通過離子交換保留；此特定吸附劑的最終洗脫液實際呈酸性。進樣溶劑的篩選結果表明，采用酸性進樣溶劑可獲得最佳的峰型和靈敏度（此處不作數據說明）。因此，Oasis WCX是不二之選。對通用的提取方法稍作修改，確保所有分析物通過離子交換可完全保留。人體尿液經SPE處理后，最終洗脫液中所有分析物的回收率為92%至104%，RSD為3%至6%。SPE洗脫液可直接進樣，不需做進一步的稀釋或蒸發，從而簡化了整個工作流程，提高了分析通量。
系統性色譜篩選
方法開發過程對色譜柱、改性劑和改性添加劑進行了系統篩選，以獲得最佳分離結果。經篩選的4種UPC2色譜柱如下：ACQUITY UPC2 BEH、BEH 2-EP、HSS C18 SB和 CSH? Fluoro-Phenyl，所有色譜柱規格均為2.1×50 mm，填料粒徑為1.7 μm。3種流動相B溶劑分別為甲醇、含0.2%甲酸的甲醇和含0.2% NH4OH的甲醇。篩選過程采用流動相B在3 min內從2%增加至45%，達到45%時保持1.5 min的常用梯度。當以添加有氫氧化銨的甲醇作流動相時，各色譜柱分析所得的峰形、靈敏度和分離度均為最佳。四種固定相使用此高pH流動相所得分析結果的對比情況如圖2所示。除HSS SB色譜柱外，其它色譜柱的出峰順序相似。但是，由HSS SB色譜柱得出的譜峰明顯更寬，這將導致信噪比降低并影響低濃度樣品的檢測。峰變寬可能是由于分析物與固定相之間的次級相互作用所致。采用ACQUITY UPC2系統分析其它類化合物（本文未涉及此部分實驗內容）時發現：使用具有緩沖作用的流動相改性劑（如，20至40 mM的甲酸銨）可以改善峰形。在本文的研究中，色譜分析的主要目標不是使分析物達到絕對的基線分離，而是獲得最佳的峰形和最高靈敏度，因此我們對各色譜柱所得的峰面積進行了測定。在高pH改性劑條件下，使用各色譜柱得出的分析物峰面積如表2所示。
圖2：以含0.2% NH4OH的甲醇為流動相B時，不同固定相的分析結果。
BEH色譜柱 | BEH 2-EP色譜柱 | HSS C 18 SB色譜柱 | CSH FP色譜柱 | |
阿米替林 | 1066581 | 940444 | 968946 | 940657 |
丙咪嗪 | 1291389 | 1180698 | 1690693 | 1145127 |
去甲替林 | 1586550 | 963422 | 1256074 | 1143857 |
地昔帕明 | 245922 | 149734 | 219268 | 208580 |
表2. 使用4種不同色譜柱所得的峰面積概覽表。
在不同色譜柱的篩選實驗中，阿米替林和丙咪嗪的峰面積無顯著變化，但地昔帕明和去甲替林受固定相化學性質的影響，峰面積發生了明顯改變。例如，地昔帕明在使用BEH色譜柱分析時所得峰面積較其它色譜柱增大了11%至40%。同樣，去甲替林的峰面積在BEH色譜柱分析條件下較其它色譜柱增大了21%至40%。雖然BEH 2-EP色譜柱的總體分離效果較其它色譜柱稍有改善，但采用BEH色譜柱時信號強度更高。因此BEH色譜柱是進行TCA低濃度水平定量分析的最佳選擇。此外，BEH色譜柱所得色譜峰的平均基線峰寬＜2 s，提高了低濃度樣品測定的信噪比。
運用各個色譜柱進行試驗時觀測到系統最大壓力低于4200 psi，系統在此低于壓力限值的條件下運行良好，可以靈活地根據需要提高流速，進一步縮短運行時間。
除對固定相進行了篩選外，本實驗還對不同的改性劑進行了評估。圖3所示為不同流動相B改性劑對ACQUITY UPC2 BEH色譜柱的影響，其它色譜柱受影響的趨勢與此相似。使用NH4OH作為改性劑時常可獲得最佳的分離度和峰形。單獨用甲醇作流動相時，所得譜峰最寬，洗脫時間最遲，分離度最差。選擇甲酸作為改性劑時，所得分析結果比使用NH4OH所得結果的保留時間增大，分離度降低且譜峰更寬。
為縮短運行時間并提高樣品分析通量，本實驗對篩選梯度進行了“壓縮”。結果表明，梯度壓縮后所得峰形、分離度和靈敏度均未受負面影響。最終的整個運行時間確定為3 min。
圖3：使用BEH色譜柱時，流動相B中加入不同改性劑后所得分析結果。
靈敏度、線性和定量準確度
本實驗還通過少量的研究對方法的準確度和線性進行了評估。使用濃度范圍為0.1-10.0 ng/mL的對照人體尿液制備簡化標準曲線（無內標物）。采用“實驗”部分最后確定的分析條件進行測定，按照1/x的加權系數計算所得的曲線呈線性，R2＞0.998，各標準曲線點理論濃度的平均偏差<8%。表3所示為阿米替林的典型標準曲線統計數據。對于所有分析物，0.1 ng/mL的LLOQ均可輕松實現。此濃度下，阿米替林、丙咪嗪、去甲替林和地昔帕明-D3的信噪比依次為334:1、292:1、590:1和66:1。各組分的信號強度是空白尿樣提取物信號的5倍，符合FDA的LLOQ測定標準。圖4所示為0.1 ng/mL地昔帕明-D3和空白尿液的典型提取離子色譜圖。
圖4. 空白尿液提取物(下方色譜圖)和含0.1 ng/mL地昔帕明-D3的尿液提取物(上方色譜圖)。
標準溶液濃度(ng/mL) | 保留時間 | 峰面積 | 與理論值之間的偏差% | 準確度% |
0.1 | 1.48 | 16161 | -3.3 | 96.7 |
0.2 | 1.48 | 27061 | 2.7 | 102.7 |
0.5 | 1.48 | 60531 | 7.9 | 107.9 |
1.0 | 1.48 | 103149 | -3.6 | 96.4 |
5.0 | 1.48 | 467997 | -7.9 | 92.1 |
10.0 | 1.48 | 999886 | -0.9 | 99.1 |
表3. 阿米替林(從人體尿液中提取)的典型標準曲線統計數據。
結論
UPC2技術成功應用于人體尿液中TCA的分析和定量。主要參數的自動篩選功能為本研究組中的4種TCA提供了極好的分離度和譜峰強度。對篩選出的梯度條件略作調整后，最終的總運行時間為3 min，尿液樣品由Oasis WCX 96孔μElution板進行提取處理。人體尿液中提取TCA的回收率范圍為92%至104%。簡化標準曲線溶液的濃度范圍為0.1-10.0 ng/mL，曲線上各點呈線性分布，平均準確度為99%。各分析物的LLOQ均可達到0.1ng/mL，足以滿足生物分析的要求。
總的來說，本應用紀要展現了UPC2這種新型分離技術在生物分析這一重要應用領域中的實用性和應用優勢。UPC2技術使用綠色環保的CO2作為主要流動相、樣品無需稀釋或濃縮即可直接進樣，另具公認的正交性（對反相色譜而言），使其在生物基質中藥物的分析定量方面備受青睞。