活體動物體內生物發光和熒光成像技術基礎原理與應用六

（二）熒光成像技術優點

在活體動物可見光成像技術中，相對于生物發光成像技術，熒光成像技術的優勢主要表現在：

1. 熒光染料、蛋白標記能力強

熒光標記物種類繁多，包括熒光蛋白、熒光分子、量子點等，可以與基因、多肽、抗體等生物分子標記，作為分子探針使用范圍廣。同時，不同的熒光蛋白或染料還可對樣本進行多重標記，同時成像。檢測的波長范圍從300~1100nm，某些儀器公司還提供全光譜的濾光片實現幾乎所有熒光標記的體內成像。

2. 信號強度大

由于熒光是在外界光源激發下產生的能量轉移現象，其光子強度較其它光學信號更強，持續時間長，信號所反應的樣本信息量更豐富，對信號接收儀器的要求相對較低，儀器不需要必須配備低溫冷CCD（如絕對溫度＜-80^oC），節省實驗成本和購置成本。

3. 實驗成本低

相對于活體生物發光成像來說，熒光成像費用低廉，無需注射底物熒光素。熒光發光基團只要在其合適強度的激發光激發下就可以發出定波長的發射光信號，整個反應不需要向動物注射任何昂貴的反應成分，只要保證熒光基團穩定，就可實現隨時激發隨時發光的效果。

4. 活體動物、動物尸體、器官全部可以進行成像

由于熒光是基于物理能量轉移原理，對實驗樣本的生理狀態要求較低，可以實現活體、尸體、尸解組織器官樣本的光學成像。而對于生物發光，只有在活細胞內才會產生發光現象。

總之，生物發光和熒光技術，如何互為補充，取長補短，分別滿足不同的研究領域，將來的發展方向是兩種技術并重。對于不同的研究，可根據兩者的特點以及實驗要求，選擇合適的方法（表11-1）。

表11-1 生物發光及熒光特點的比較

四、活體動物可見光成像儀器原理與操作流程

（一） 儀器原理

以NightOWL ⅡLB 983為例，來說明活體動物可見光成像系統的儀器設計原理。整個儀器由CCD配合密閉性非常好的暗箱、熒光配件、麻醉系統和軟件組成。CCD鏡頭位于暗箱的左上方，熒光光源和光路位于右上方，動物平臺（可加熱，以保持觀察實驗動物的體溫）位于暗箱的下方，麻醉系統通過管道與暗箱連接。

選擇適當的CCD鏡頭，對于體內可見光成像是非常重要的。選用的CCD鏡頭對于波長450-700nm的光必須具有非常高的靈敏度和量子效率，而且由于需要探測的光源在皮下幾厘米處，其噪聲信號要盡可能的小。科研人員經過探索發現，背照射背部薄化冷CCD是唯一合適的選擇。這種CCD芯片溫度可達<-80⁰C，在該溫度下，芯片的暗電流和閱讀噪音降到幾乎可以忽略不計的水平，同時配合密閉性非常好的暗箱，使得該系統檢測生物發光和熒光具有無與倫比的靈敏度。CCD由軟件控制升降，自動聚焦，可以獲得從3.5厘米到25厘米的連續視野。

成像暗箱屏蔽宇宙射線及一切光源，可以使暗箱內部保持完全黑暗，CCD所檢測的光線完全由被檢動物體內發出，避免外界環境的光污染。

在熒光配件的設計方面，光源采用75W的鎢鹵燈，該系統首先實現了熒光激發光源能量從0%-100%可調節，并通過光導纖維反饋控制激發能量在檢測時間內保持穩定，有利于定量的準確性。另外，還通過采用均勻照射的激發裝置、窄波帶的濾光片等保證熒光成像能較好的去除背景噪音的影響，獲得清晰的檢測結果，較準確的定量數據。

為了對實驗動物進行可見光成像，需要將實驗動物進行麻醉，以獲得期望的觀察角度及穩定的數據。對于生物發光成像來說，由于檢測的時間較長，一般建議使用氣體麻醉。氣體麻醉系統組成包括：氣體蒸發器、誘導麻醉箱、流量調節閥、單獨控制開關的五通道小鼠麻醉室、廢氣吸收裝置等組成。在成像前，將實驗動物置入誘導麻醉箱并被麻醉, 然后放入成像暗箱進行觀察

軟件系統負責儀器控制和圖像分析。軟件控制鏡頭的焦距、CCD的升降、曝光時間、濾光片的更換和照明燈的開啟等，具有友好的用戶界面，操作簡便。