2. 方法與結果
為了從激光掃描顯微鏡的功能性成像中得出重要結論，一個高的時間分辨率是很重要的。在低光情況下，這通常通過進行單線掃描來獲取。這被以一個垂直系統（VS）神經元的突觸前分支的激光共聚焦(Leica SP2)鈣離子成像示例 (see Fig. 1, Table 1). 這類神經元對其感受野內的向下運動以其膜電勢的逐級去極化的方式響應，這伴隨著突觸前分支精細末端的鈣離子聚集(Kurtz et al., 2001).為達到一個高的時間分辨率(400 Hz)，執行了單線掃描。記錄中顯示，掃描線應該擊中了不同直徑的兩個神經元。模式運動期間鈣離子指示染料熒光相對基線熒光的增加表明了細胞溶質自由鈣離子濃度的增加。精細神經突中鈣離子信號變化更快，不論是刺激動作期間的上升和刺激動作中止后的下降。
Fig. 1. Top: schematic of the fly’s head (caudal view). Vertical System (VS) neurons form an ensemble of 10 cells, belonging to the visual motion-sensitive tangential cells in the fly brain. To study calcium concentration changes in these neurons the lobula plate region was exposed, a single VS2-neuron was impaled with a sharp glass electrode for intracellular recordings and the electrically charged, membrane-impermeant calcium dye Oregon-Green 488 BAPTA-1 was driven into the cell by applying hyperpolarizing current (?1 to ?2 nA for 3–5 min). Bottom: single-line scans were performed at the presynaptic region of the VS2-neuron with a Leica SP2 confocal microscope equipped with a long-distance water-immersion 40×/N.A. 0.8 objective (excitation 488 nm, emission 500–560 nm, scan frequency 400 Hz). The arrow below the image of the presynaptic arborizations (left) indicates line position. During downwards motion of a squarewave grating (spatial wavelength: 32?, temporal frequency: 4 Hz, Michelsen contrast: 99.3%) intracellular free calcium rised, leading to an increase in dye fluorescence (middle). The time course of relative fluorescence changes (_F/F0) is shown averaged over regions containing signal from the upper, thinner neurite (right, black trace) and the lower, thicker neurite, respectively (grey trace). Both the rise of the calcium signal during pattern motion and its decline afterwards appeared faster in the thin neurite. For a more detailed description of animal preparation, electrophysiological procedures and visual stimulation see Kurtz et al. (2001).
在高度分支化的結構，如樹突和突觸前分支中，對通過單線掃描到的個體神經元間的鈣離子動態差異進行系統分析是困難的，因為是否是一個以上感興趣的區域被掃描線擊中是很難控制的。為在一定程度上解決這個問題，我們推出了一種方法，通過多束激光取代單激光束的TPLSM進行鈣離子成像。
2.1. 多線TPLSM的原理
來自一個可調諧Ti：Sa激光器(see Table 1)的脈沖化的近紅外激光被導向一個基于鏡面的光束分光器(Nielsen et al., 2001). 光束分光器的原理是組合了一個位于中央的50%光束分光鏡和位于兩側的高反射鏡(see Fig. 2). 光束分光器將入射光分為兩束，高反射鏡將光束重復送回中央的光束分光鏡。這個過程產生了高達64束的成一列的激光束陣列。
在我們早期實驗中(see also Kalb et al., 2004)使用的光束分光器包含了一個單一光學元件組，每一個元件都被固定在無振動平臺上，并可直接調整。在后期實驗中（此處所列數據都基于此實驗），為了方便，這個用戶定制的分光器被用一個新近開發的市場上可以買到的分光器(TriM-Scope, LaVision BioTec, Bielefeld, Germany)所取代。后者配置中所包括的關鍵組件有衰減器，光束望遠鏡，色散補償，光束分光器，和xy掃描振鏡，都被裝在一個盒子里。
通過掃描器后，激光陣列從背后端口進入倒置顯微鏡(Olympus IX70)。一直暴露大腦的蒼蠅，其一個單獨的TC被鈣離子敏感染料填充以用于熒光成像，被固定在顯微鏡載物臺上。一個提供視覺刺激的LED板被放在蒼蠅視野之內。
