淺談熒光在酶標儀上的應用以及新一代酶標檢測系統（Paradigm+Tune）的優勢
前言
我們知道目前生命科學及現代分子生物學主要集中在對核酸和蛋白質等生物大分子的分析以及進行一些細胞水平的研究。傳統的分析方法是采用放射性同位素作為一種示蹤劑，標記在各種生物大分子或者細胞中來研究它們之間的相互作用和變化，但是放射性同位素對環境具有一定的破壞性，對人體健康也具有一定的損害，所以各國的科學家都致力于研究和應用高靈敏度的非同位素檢測方法，利用熒光探針作為一種標記物，以其自身的一些優勢而得到廣泛的應用。目前對熒光進行檢測的儀器種類很多，例如我們常見的熒光顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡、流式細胞儀、多功能讀板儀（酶標儀）等，普通的熒光顯微鏡只能觀察物質形態，不能給出量化指標，而流式細胞儀又因其價格昂貴和操作復雜不能得到廣泛的應用。酶標儀作為一種熒光信號檢測儀器，具有很多優勢，不但價錢便宜、個頭小、操作簡便，而且還可以根據熒光信號特點和強弱來對物質進行定性和定量的分析。目前市面上支持熒光檢測的多功能酶標儀種類很多，例如Molecular Devices的SpectraMax系列的M2，M3，M4和M5，和目前市面上唯一一款可以完成快速動力學實驗的Flexstation 3等。
熒光產生機理
熒光探針（熒光染料分子）在光的照射下，物質的電子吸收能量后，可由低能級的電子層（內電子層）跳到高能級的電子層。此時，電子由低能態進入高能態。高能態的電子是不穩定的，他會在極短的時間（10-8s）內，以輻射光量子的形式釋放能量后，再回到原來的能態。這時發射出的波長比激發光的波長要長，如果在可見光波長的范圍內，為人眼所能看見的光，這種光稱之為熒光。熒光是發光體分子中處于激發態的原子核外電子由高能級回到低能級所產生的輻射，因此是冷光。熒光的顏色多為藍色、綠色、紅色和黃色等。
熒光檢測技術優勢和影響因素
熒光檢測技術具有靈敏度高、特異性好、動態范圍寬、無放射性污染等優點；但也易受到反應體系中PH值和環境溫度的影響，另外如熒光淬滅、光漂白等現象也會對熒光信號的檢測產生較大的影響。
我們可以根據熒光探針分子特性（半衰期不同）將熒光檢測技術分為熒光強度（FI）和時間分辨熒光（TRF）兩大類。
熒光強度（FI）
熒光強度即發射熒光的光量子數，熒光強度決定了熒光色素檢測的靈敏度。利用熒光強度進行物質定性：即不同的熒光物質有不同的激發光譜和發射光譜，因此可用熒光進行物質的鑒別。也可進行物質的定量測定：利用在較低濃度下熒光強度與樣品濃度成正比這一關系可以定量分析樣品中熒光組分的含量。熒光強度檢測技術在生物學上的應用非常廣泛，可以進行生物大分子定量、酶活性分析、熒光免疫分析、細胞學分析（細胞增殖、細胞毒理、細胞吸附等）、胞內鈣離子濃度的變化、熒光蛋白的報道基因分析 (GFP)、細胞凋亡等。
細胞增殖檢測
目前細胞增殖檢測普遍采用MTT方法，其原理是活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍紫色結晶甲瓚（Formazan）并沉積在細胞中，DMSO溶解后，酶標儀在490nm波長處測定其光吸收值，此法可間接反映活細胞數量。但是其步驟比較繁瑣，且MTT對人有致癌性。所以熒光檢測方法以其自身許多優點越來越得到大家青睞，以（Invitrogen）CyQuant細胞增殖檢測試劑盒為例,其為一種綠色熒光探針，能與細胞裂解液中的核酸特異結合,其檢測靈敏度可達50cell-50000cell/200ul，整個反應過程是免洗的，適合高通量實驗，并且不易受到細胞培養液中血清等成分干擾。
細胞內鈣流檢測
鈣離子是機體的重要元素，作為細胞內第二信使通過與鈣調蛋白結合激活多種蛋白激酶（如腺苷酸環化酶、磷酸二酯酶、鈣調蛋白激酶等）及諸多蛋白水解酶和核酸酶，從而參與包括細胞代謝、細胞周期等多種細胞功能的調節，在細胞的許多生命活動中擔當著重要的角色。傳統的 Fura-2，indo-1，Quin-2是Ca2+熒光指示劑，可以反映細胞內鈣離子濃度的變化，當結合鈣離子時，最大激發波長會發生改變，發射熒光的強度和結合的Ca2+濃度有著定量的關系，但是這些鈣流檢測試劑有其自身一些缺點，首先整個反應過程需要水洗，不適合高通量實驗要求，其二對溫度敏感，光穩定性差。Molecular Devices針對于鈣流檢測特點推出了一系列檢測試劑盒，首先采用ZL的quanch技術，整個反應過程不需要水洗，增加檢測通量，其次采用特殊的熒光探針，與鈣離子結合后其穩定性較好，熒光信號強等優點得到很多實驗者的肯定。