經3D細胞培養支架培養的骨髓間沖質干細胞圖片--復蒙基因
自WillhelmRoux于1885年從雞胚中分離細胞首次建立體外細胞培養, 單層細胞培養技術已有百余年的歷史。一個多世紀以來,單層細胞培養有了蓬勃的發展, 特別是在制藥或者疫苗合成等產業化領域, 通過細胞的快速分裂,從而高效率地制造產品。但在生命科學基礎研究領域, 對于細胞的體外培養, 關注的不僅僅是它們的分裂生長,而更為重要的是它們經過傳代后能否維持體內的性狀。在很多情況下, 單層細胞培養技術所取到的研究結果和體內的情況不符合,因為細胞在體外改變的環境下增生, 逐漸喪失了原有的性狀。動物實驗完全在體內進行,但由于體內的多種因素制約以及體內和外界環境相互影響而變得復雜化, 難以研究單一過程。另外, 我們在動物身上所觀察到的結果,往往是最終呈現的表現, 而非研究者最為關心的中間過程。顯然, 如何填補單層細胞培養和動物實驗的鴻溝,一直是生命科學家思索的問題。尤其是在發育生物學領域, 迫切需要建立一套細胞培養技術, 既能生長傳代, 還能最大程度地維持體內性狀,并分化產生新的組織結構, 以便全面研究發育過程。隨著組織工程的新興發展, 三維細胞培養技術就應運而生了。
1 什么是三維細胞培養技術
體外細胞培養的一個重要原則是需模擬體內細胞生長環境,該模擬系統中最重要的核心因素是細胞與培養環境之間的相互作用。不同于傳統的二維化單層細胞培養, 三維細胞培養技術(three-dimensional cell culture, TDCC)是指將具有三維結構的不同材料的載體與各種不同種類的細胞在體外共同培養, 使細胞能夠在載體的三維立體空間結構中遷移、生長,構成三維的細胞-載體復合物。三維細胞培養是將細胞培植在一定的細胞外基質中, 細胞外基質( extracellular matrix,ECM) 蛋白充當生長支架, 使得細胞能夠分化產生一定的三維組織特異性結構, 所創建的細胞生長環境,則最大程度地模擬體內環境。TDCC作為體外單層細胞系統的研究與組織器官及整體研究的橋梁,顯示了它既能保留體內細胞微環境的物質及結構基礎,又能展現細胞培養的直觀性及條件可控性的優勢。近幾年三維細胞培養技術在組織形成、血管發育和器官再造等發育生物學的分支領域得到了廣泛的應用;同時在篩選新藥的療效分析和毒理實驗方面, 利用三維培養獲得了和二維單層培養完全不同的結果, 引起了藥物學家的極大興趣。
2 三維細胞培養支架材料
細胞賴以生存的三維空間，其功能是為細胞提供生存空間，使細胞獲得足夠的營養物質進行氣體交換，并使細胞按預制形態的三維支架生長，成為使細胞生長良好的三維界面。理想的生物支架材料應具備以下特點：良好的生物相容性、可降解性、足夠的孔隙結構、促進細胞黏附與增殖、具備承載生長因子的能力、支架的容積應能保持不變、支架能與周圍組織融為一體、不易從缺損區脫落、具有一定的彈性、具有關節軟骨的分層結構。常用的支架材料有：天然生物材料、人工合成高分子材料、無機材料以及這些材料的復合物。
2.1天然高分子材料
天然生物材料主要包括：膠原、明膠、纖維蛋白、殼聚糖、瓊脂、糖胺多糖(如：透明質酸、硫酸軟骨素等)、藻酸鹽、蠶絲蛋白、松質骨骨基質、脫細胞基質等。天然支架的優勢在于有利于細胞包埋，抗原性低、無毒性、無致炎性、能促進細胞生長和粘附等。但天然材料的缺點是機械性能差，一方面不適應塑性的需要，另一方面，在體內水解過程中不能保持空間構型并且吸收過快，其應用受到限制。再者，天然材料每批之間都有差別，難以大批量加工生產。
目前，市場上商品化的三維支架產品多以Matrigel、膠原復合物為主。膠原是天然蛋白質的一種，廣泛存在于動物的皮膚、骨、軟骨、牙齒、肌脾韌帶和血管中，占人體蛋白質總量的30%以上，是結締組織極重要的結構蛋白質，起著支撐器官、保護機體的功能。膠原一般是白色透明、無分支的原纖維，它的周圍是由多糖和其他蛋白質構成的基質。膠原蛋白分子肽鏈上具有多種反應基團，如羥基、羧基和氨基等，易于吸收和結合多種酶和細胞，實現固定化，它具有與酶和細胞親合性好、適應性強的特點。膠原具有重要的生物學性質——力學性能高、促進細胞生長、止血、生物相容性和生物降解性。已有報導，膠原可以作為移植載體用于骨介入蛋白——骨形態基因蛋白2(rhBMP2)的載運。膠原現已被廣泛應用于作為傳送培養好的皮膚細胞和藥物的載體，以進行皮膚替代和燒傷治療。另外膠原是一種成膜性好的物質，并具有生物相容性，在體內可被逐步吸收，因此，膠原蛋白固定化酶特別適合于人工應用材料。但其同時也存在某些缺點，諸如難以規模制備，機械強度較差，對感染部位的療效不顯著等。商品化的膠原復合物支架有牛皮、雞爪等來源。Matrigel是從小鼠腫瘤組織中提取的抽提物, 這為三維培養介導的針對人體的干細胞臨床治療帶來了風險。
2.2 無機材料
目前常用的無機材料有羥基磷灰石、磷酸鈣骨水泥、磷酸三鈣等，此類材料主要應用于骨骼組織工程。
羥基磷灰石（hydroxyapatite,HA）是人體和動物骨骼的主要成分,這種材料的研究歷史久遠。HA脆性大、抗壓性能比骨組織小，雖然植入體內后，由于組織、細胞的侵入，其強度會逐漸升高達到松質骨強度，但是有研究人員認為HA在體內吸收過慢，不利于愈合的骨骼承受應力和新骨形成。同羥基磷灰石相似，磷酸三鈣(tricalciumphosphate,TCP)具有良好的生物相容性及可吸收性，但是缺乏孔隙、顆粒較小、易分解（6周）、脆性大及不耐壓等缺點，限制了其應用。用磷酸鈣、碳酸鈣、磷酸三鈣為原材料在室溫下發生系列聚合反應合成磷酸鈣骨水泥（calciumphosphatecement,CPC），這種化學復合物的晶體結構與天然骨相似，可以塑形，有良好的骨形態和力學特點，能夠提供機械完整性。其孔隙率大約為50%，與羥基磷灰石相似，但脆性大，其降解時間較長，約需2年左右。另一方面，磷酸鈣骨水泥材料內部的孔隙直徑小于1mm，成骨速度慢，目前的研究重點是如何將其與大孔隙材料復合以提高吸收速度及加快成骨。
總的來說，此類材料具有較高的壓縮強度、耐磨性和化學穩定性，并可在生物體內發生降解，被新生骨組織吸收和替代，是骨組織支架常使用的材料。但存在多孔體強度較差、加工困難、形成的支架孔隙率低、脆性大、組織不能完全長入等缺點。