一、樣品的預處理
樣品的預處理包括給藥、切片或細胞標本的制備。其中給藥過程要根據實驗目的來進行，在這里主要介紹切片和細胞標本的制備。
1、組織切片樣品的處理
其制作過程主要包括組織樣品固定、切片制作。組織切片的優點是能夠完好地保存細胞間的相互關系和結構，因此是生物醫學實驗中應用廣泛的樣品形式。用于共聚焦顯微鏡測定的切片形式有：活的組織切片、冰凍切片及固定切片。活的組織切片無需固定，活體直接切片后用于觀察或測定組織具有活性狀態下的一些生理指標。該類切片的缺點是保存條件要求高、時間短，切片比較厚，深層不容易染色。冰凍切片的優點是熒光背景低，引入雜質干擾少，常用于免疫熒光的標記和檢測。
2、細胞標本的制備
熒光標記前細胞標本的制備過程包括細胞的培養和細胞的預處理等步驟，細胞的培養和預處理要注意細胞種類和純度、密度、細胞形態等應符合實驗目的。
①細胞種類和純度實驗所選用細胞的種類一般是由實驗目或測定指標決定,但是有時會出現細胞種類不純的現象,雜細胞的干擾會導致錯誤的實驗結果,這種現象在原代分離和培養的細胞中尤為常見。例如原代培養的血管平滑肌細胞中,容易混合有內皮細胞和成纖維細胞:大腦皮層神經元易與膠質細胞相混合,因此實驗中應注意簽別細胞的種類和純度,采用相應的方法對細胞進行純化。
②細胞密度和形態
實驗中調整不貼壁細胞和貼壁細胞的細胞密度的方式是不相同的。不貼壁細胞包括直接消化分離的細胞和懸浮生長的細胞,其密度可以通過改變細胞數與溶液體積的比例來調節。
貼壁細胞的密度由其細胞種類、接種密度、細胞鋪展面積及間距、細胞增殖速度、生長的時間等來決定。從貼壁細胞的生長方式看,有些是細胞相互連接成片地生長；有些則可以分散成單個細胞生長。要根據實驗目的調整細胞接種密度。如果實驗目的是對細胞個體進行形態學觀察、三維重建、定位熒光信號,則細胞密度可以稀疏一些,這樣可以使細胞充分伸展,顯示出應有的形態和結構,但也要注意保證顯微鏡視野內有一定數目的細胞,以便能夠觀察和統計多個細胞,選取出有代表性的形態結構,反之如果細胞密度過低,細胞數少,則缺少觀察過程中的統計意義,而且熒光染色后上機測定時,尋找細胞花費時間太多,激發光長時間照射易引起熒光滅；這就要求細胞所占面積要不低于視野20%。如果實驗目的是動態或靜態定量測定熒光強度時,則細胞的密度應該高一些,以便做大量細胞的統計定量,細胞約占視野面積的80%,這時觀察分散生長的細胞可以看到細胞布滿視野但相互間又有空隙、盡量不連成片。無論單個生長還是成片生長的細胞密度不能太高,要保證細胞不聚堆擁擠,以防止細胞相互間熒光互映和擠壓變形,影響定量結果。
二、用熒光探針標記樣品
標記方式：直接標記，生物樣品與熒光探針直接作用，使樣品具有熒光。間接標記法：熒光探針將某些特定分子標記，這些特定分子再與細胞作用，使樣品具有熒光，如免疫熒光法，熒光標記的藥物。顯微注射法：利用顯微注射向細胞內導入熒光探針，此法得到的熒光細胞少，適合監測少量細胞。膜通透法：利用透膜劑，低滲培養液短期刺激增強探針跨膜能力，從而使探針進入細胞中。
確定熒光探針標記樣品的條件：標記探針的濃度，反應溫度，時間等。
三、熒光探針標記的注意事項
熒光強度過高：看不清細胞結構細節，不利于形態觀察，可降低探針濃度，減少反應時間。
熒光強度弱：熒光探針濃度過低，標記條件不當，探針溶解不充分，探針選擇錯誤等。
在操作過程中，避免對樣品造成損傷防止影響實驗結果
熒光標記要避光進行。
防止非特異性標記，設立正確的對照組。
熒光標記后要盡快
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