系統體積被定義為從梯度形成點到色譜柱前端的體積。系統體積用于聚焦梯度的設計。如圖1所示，本試驗所用儀器配置下的系統體積是3.0 mL。
設計聚焦梯度
第1步
在2.47分鐘洗脫3號色譜峰的溶劑濃度在較早的時間點上形成。如圖3所示，檢測器和梯度形成點之間的偏移量等于系統體積加上柱體積。用于這臺特定系統的偏移量等于早期確定的3 mL系統體積再加上19 x 50 mm制備柱的體積（11.9 mL），即14.9 mL。在25 mL/分鐘的流速下，溶劑濃度到達檢測器需要0.59分鐘。2.47分鐘的洗脫時間減去0.59分鐘的偏移時間等于1.88分鐘。由于初始大規模梯度有0.39分鐘的保留時間，因此形成洗脫色譜峰的乙腈百分比的時間是1.88分鐘減去0.39分鐘，即1.49分鐘。
第2步
計算在2.47分鐘洗脫色譜峰的乙腈百分比。原始大規模梯度在5分鐘內洗脫 5-50% B，最初梯度的駐留時間為0.39分鐘。
根據在2.47分鐘洗脫出色譜峰的梯度計算得到的乙腈百分比是13.4%，但由于梯度開始于5%乙腈，因此洗脫該峰的乙腈實際濃度是13.4% + 5%，或者說18.4%乙腈。
第3步
旨在分離梯度中部洗脫時間接近的色譜峰的聚焦梯度應開始于原始小規模試驗條件，通常為0-5% B。進樣開始后立即將梯度快速增加至比能洗脫目標峰的預期乙腈百分比濃度低5%的乙腈百分比。在搜索梯度中所用的1/5斜率下繼續進行緩的聚焦梯度部分。預計一個五倍的更緩梯度可為洗脫時間接近的色譜峰提供更高的分離度。終止高出可洗脫目標峰的預期乙腈百分比濃度5%的聚焦梯度部分。原始梯度在5分鐘內洗脫5-50% B，或者說在5分鐘內梯度變化45%。這樣，乙腈濃度每分鐘變化9%（從9%-10%左右簡化得到）。然后，新的梯度斜率應為10%的1/5，或者說每分鐘變化2%。10%的乙腈濃度改變通過每分鐘變化2%而達到，說明用于分離3號和4號峰的聚焦梯度時間片段應持續5分鐘。一旦梯度的聚焦部分完成，乙腈百分比快速增加至95% B，以清洗色譜柱。平衡色譜柱后，終止初始條件下的梯度。5-45% B = 每分鐘9%（舍入至每分鐘10%）梯度斜率每分鐘變化2%。
