前言介紹
阿爾茨海默病(AD)首次是德國神經病理學家A. Alzheimer于1907年公布的,它被公認是導致癡呆的主要因素.
原理
此固相ELISA檢測試劑盒運用兩個高特異性抗體.加入TMB底物液后作為顯色劑.顯色的強度與人的總可溶性淀粉樣前體蛋白(sAPP)的量成正比.
檢測范圍
0.39 - 25 ng/mL
預期用途
供研究用,不能用于診斷過程.
■ 此IBL檢測試劑盒能用于人血清,EDTA血漿,腦脊液,細胞培養基上清液的總sAPP的定量檢測.
■ 建議血清樣本稀釋超過4倍,EDTA血漿樣本稀釋超過2倍,腦脊液樣品超過16倍.
試劑盒組成
1預包被板:抗人-APP (R12A1)小鼠IgG單克隆抗體,親和純化 96T
2濃縮酶標抗體(酶聯物) 0.4 mL x 1
3標準品:重組人sAPPα蛋白 0.5mL x 2
5酶聯物稀釋液 12mL x 1
8濃縮洗滌液:40× 50mL x 1
操作說明
1所需實驗器材(但本試劑盒沒有提供)
酶標儀(450nm) 微量移液管及吸嘴
量筒及燒杯 去離子水
冰箱(4°C) 坐標紙(log/log)
吸水紙 試管
洗瓶
用于“2濃縮酶標抗體”及“6底物液:TMB溶液”的一次性試管
2準備
1) 洗滌液的準備
“8濃縮洗滌液”是一種40倍的濃縮液.放置至室溫后,把50 mL的濃縮液溶于1950 mL的去離子水中(即按1:40稀釋)制成稀釋洗滌緩沖液,置于冰箱中能保存2周.
2) 酶聯物的準備
“2濃縮酶標抗體”是一種30倍濃縮酶聯物,使用一次的試管用“5酶聯物稀釋液”稀釋“2濃縮酶標抗體”制成所需的酶聯物液.(根據所需的量按1:30稀釋)
3) 標準品的準備
取0.5 mL的去離子水加入瓶裝“3標準品”,混勻制成50 ng/mL的人sAPP標準品
4) 標準品的稀釋
準備8支試管用于標準品稀釋并編號.各加230 μL “4EIA緩沖液”于各試管中.再取230 μL標準品溶液于試管1,混勻.然后再從試管1中取230 μL溶液放到試管2中,按此規律,如下圖如示配制系列標準品.第8支試管為0 ng/mL作為零標準品.
5) 樣本的稀釋
樣本必需用試劑盒提供的“4EIA緩沖液”稀釋.如果樣本中的sAPP濃度范圍不清楚,建議預配制幾種不同濃度來確實合適的檢測濃度.
檢測步驟
將所有的試劑平衡至溫室(大約30分鐘),使用前混勻.確保試劑無質量問題.在檢測樣本的同時要準備標準品制成標準曲線.
檢測流程圖如下:
1設試劑空白對照.加100 μL“4EIA緩沖液”于微孔中.
2各加100 μL樣本空白(試管8),系列標準品(試管1-7) ,樣本于相應的各孔中.
3在蓋板后在4°C孵育過夜
4用洗瓶洗板.然后再加入洗滌緩沖液,無需蓋板放置15-30秒左右,再完全移除洗滌緩沖液.此步驟需重復至少7次. 最后在吸水紙上輕扣去除所有殘留液滴.
如有用自動洗板機,在洗板機上洗板4次后,上述的人工洗滌步驟仍需重復3次.
5各加100 μL酶聯物溶液于各孔中.
6蓋板后在4°C下孵育30分鐘
7按步驟4洗板9次.
8加所需量的“6底物液:TMB溶液”至一次性的試管中.再各取100 μL底物液于相應各孔中.注意一次性試管內的多余底物液切勿倒回瓶中,避免交叉污染.
9避光在室溫下孵育包被板30分鐘.加入底物液后,孔內的液體會變成藍色.
10各加100 μL“7終止液”至各孔中,輕扣板條混勻.加入終止液后孔內的液體會變成黃色.
11去除板底的污垢或液滴,確保無氣泡形成,在加入終止液后30分鐘內用酶標儀于450 nm處測其吸光度值.
特別注意
1樣本收集后應立即檢測.如是冷凍儲存的樣本,則需解凍,避免反復凍融.
2樣本必需用“4EIA緩沖液”稀釋.
3建議樣本和各標準品做雙份檢測
4樣本應保持在中性PH范圍內.因為有機溶劑的污染會影響檢測結果
5只可以用試劑盒提供的洗滌緩沖液用于洗板,不充足的洗板可能會導致錯誤的結果.
6在吸水紙上輕扣板去除殘留液滴.切勿用吸水紙刮擦微孔.
7“ 6底物液”需避光保存,避免讓其與金屬接觸.
8加入“ 7終止液”后,30分鐘內必需讀數.
結果分析與計算
所有的測量的吸光度值(包括標準品,未知檢測樣本)都需減去樣本空白對照的吸光度值.在雙對數坐標紙上,以標準品濃度作為橫坐標,以相對應的吸光度作為縱坐標,通過光滑的點繪制標準曲線.檢測樣品的濃度可直接在標準曲線讀取.
以上的標準曲線僅供示例演示,不能用于樣本結果的讀取.每次檢測都必需建立其標準曲線.
本譯文僅供參考，詳情請以原文為準。