生物標志物研究與早期藥物研發基因表達分析功...（三）

靶基因表達標準化參考基因選擇
對于相關定量分析來說，通過參考基因表達進行靶基因表達標準化。理想情況下，標準化處理應該能夠補償 RNA/cDNA起始量變異情況，以及cDNA合成或 PCR 擴增中潛在抑制劑的作用。參考基因作為內源性樣本材料對照，工作流中，與靶基因一同被處理。為獲取可靠結果，標準化中選擇合適的參考基因非常重要。合適參考基因即：在感興趣的樣本中，性能比較穩定的、非表達調節基因（4，5）。如圖 1，于 4 個參考基因中選擇出 2 個基因作為參考基因。

圖 1：9 種細胞系 4 種參考基因表達分析。 本研究 9 種細胞系 4 種參考基因絕對Cq值（重復檢測）作圖。使用同樣cDNA混合液進行PCR。分析 顯示，兩個參考基因模式相似，參考基因為：ALAS1 （氨基酮戊酸鹽、Δ-、合成酶 1）與 HPRT（次黃嘌呤磷酸核糖轉移酶 1）。第 3  個基因：MRPL19（線粒體核糖體蛋白 L19）性能非常具有可比性，第 4 個基因：G6PDH（葡萄糖-6-磷酸脫氫酶），具有獨特模式。因此，我們將 ALAS1 與 HPRT 作為參考基因，進行相關基因表達分析。

差異基因表達結果
各種實體腫瘤 9 種細胞系 NF-kB panel與 RNA 基因表達分析中，通過Cq值標準化處理，以及聯合使用 2 個參考基因（RG），確認出 35 個差異表達基因。Δ Cq計算如下：Cq_RG – Cq_靶值，Cq_RG是參考基因：ALAS 與 HPRT Cq均值。9 種細胞系 TWEAK 受體（Fn14）差異表達模式見圖 2

體內移植片研究對RealTime ready NF-kB定制型多孔檢測板體外確認的潛在藥效學標志物進行確認
應用治療復合物后，藥效學生物標志物（功能性生物標志物）會發生改變，并顯示治療反應（6）。確定治療復合物相關劑量非常重要。參數選擇后，使用體內小鼠模型，對體外確定的假設生物標志物進行驗證。使用移植物來源的新鮮凍存（FF）組織樣本對所選生物標志物進行檢測。圖4顯示相關安慰劑對照的抗- TWEAK  處理移植物小鼠潛在藥效學生物標志物相關基因表達比率。研究發現，用藥后，基因表達降低。

圖 2：9 種細胞系TWEAK受體基因表達。 相關比率（log 2 量表）計算如下：ΔCq = Cq_HK – Cq_Fn14。以細胞系與時 間點作圖。進行 ALAS1 與 HPRT1 標準化處理。 ACHN：人腎細胞腺癌 Caki：人腎透明細胞癌細胞系 SJSA：人骨肉瘤；多源肉瘤 PANC-1：人胰腺癌；上皮樣細胞系 MDA-MB 231：人乳腺癌模型；乳房；乳腺；胸腔積液 AsPC-1：人胰腺腺癌 SK-MES-1: 人肺癌 NCI-H322M: 細支氣管肺泡腺癌 22RV1: 人前列腺癌移植片細胞系

通過RealTime ready NF-kB定制型多孔檢測板體外腫瘤細胞系與體內移植物研究，可發現潛在反應性預測標志物。
反應性預測（臨床反應）生物標志物可顯示：個體對治療性復合物是否會產生最佳反應性（6）。著名事例：HER2/neu與Herceptin。
確認潛在反應性預測生物標志物，所選9種細胞系相關基因表達（參見圖 2）與小鼠模型移植腫瘤生長抑制之間具有相關性。1或24小時收集的細胞系為未處理細胞系，使用抗-TWEAK進行小鼠處理。細胞系基因表達結果表明，重現性非常高，處理時間或培養對表達結果無影響。小鼠模型腫瘤生長抑制（TGI）與細胞系潛在生物標志物相關基因表達之間相關性較高，見圖3。

圖 3：細胞系中反應性預測生物標志物 1 基因表達與體內腫瘤生長抑制(TGI)結果之間相關性較高。 RealTime ready NF-κB 定制型多孔檢測板中基因表達結果與體內 TGI 作圖。“生物標志物1”基因表達增加與 TGI 具有相關性。