FFPET 樣本特異性RealTime ready qPCR檢測潛在生物標志物假設檢驗
我們使用的第一套臨床樣本來自于各種用于人類研究的福爾馬林固定、石蠟包埋（FFPE）組織。腫瘤來源的
FFPE 組織是臨床試驗或生物標志物研究中，治療復合物研發最具有相關性的樣本材料。使用 High Pure RNA Paraffin
試劑盒，從 FFPE 組織（例如：10um切片）中提取RNA，修訂操作方案見“材料與方法”
章節的描述，其后是特異性優化與功能學檢測RealTime ready RT-qPCR分析。
由于福爾馬林固定，以及保存條件的原因，FFPET樣本分離RNA呈片段狀（7）。對于FFPET來源的RNA來說，為提高靈敏性與重現性，使用長度小于100bp的小片段擴增子非常重要。RealTime ready 檢測專用于小片段擴增子的擴增。所有擴增參數均應是RNA特異性，無人類基因組DNA污染。可通過引物探針設計來避免污染，引物探針序列可跨越外顯子-內含子交界區。假基因應該是無法擴增的，但并不是所有假基因均已知，或已被發表，必須在對照反應中，使用人類基因組DNA進行假基因檢查。RealTime ready 專用于各種 FFPE 來源的，用于人類研究的腫瘤樣本（例如：BC、CRC）的分離 RNA 檢測，并受到各種 FFPE 來源用于人類研究的腫瘤樣本分離RNA檢測的檢驗。根據以下參數，進行最佳RealTime ready RT-qPCR檢測選擇：靈敏性、線性度、重現性與特異性。根據所感興趣組織中參數表達級別，cDNA合成所用特異性引物靈敏性應該更高（參見圖 5）。
A) 生物標志物 3/腎隨機引物 B) 生物標志物 3/FFPET BC隨機引物 C) 生物標志物 3/FFPET BC特異性引物 圖 5：潛在“生物標志物 3”RealTime ready qRT-PCR 擴增曲線。來自腎
RNA（A）與 FFPE 乳腺癌（BC）樣本（B 與 C）系列稀釋 RNA 模板。使用 250 ng，最低含量 0.4 ng 1：5 稀釋的
PCR 反應混合物（A 與 B），或 100 ng，最低含量 0.16 ng 1：5 稀釋的 PCR 反應混合物（C）進行 PCR
啟動。C中，使用特異性引物而不是隨機引物進行cDNA合成啟動，以提高靈敏性。
Cq值見表 1。
結論
使用體內以及體外模型，假設生成生物標志物研究中，以及人
FFPE研究樣本假設檢驗中，可成功應用RealTime ready RT-qPCR
檢測。已經確立并對不同樣本工作流程方案進行描述。使用
High Pure RNA Paraffin試劑盒，可從FFPE組織樣本中分離出RNA，
通過RealTime ready檢測，可進行qRT-PCR分析。
參考文獻
1. NIH Biomarker Definitions Working Group, Clin Pharmacol Ter 2001; 69: 89–95.
2. Winkles, J. A. (2008) Nature Reviews, Drug Discovery 7(5): 411–25.
3. RDR report # 1042689 (Draft vers. April 2011)
4. Bustin, S.A., et al. (2009) Clin Chem 55 (4): 611.
5. Vandesompele, J. et. al. (2002) Genome biology 3 (7)
6. de Koning, P. & Keirns, J. (2009) Biomarkers Med 3(6): 685–700.
7. Masuda, N., et al. (1999) Nucleic Acids Research 27 (22): 4436–43.
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僅用于生命科學研究。不可用于臨床診斷。
LIGHTCYCLER、MAGNA PURE、HIGH PURE與REALTIME READY是羅氏公司注冊商標。