特異性試劑的制備
cGMP AChE示蹤液
100dtn cGMP AChE示蹤液與6ml的緩沖液
或500 dtn cGMP AChE示蹤液與30ml的緩沖液
配制的cGMP示蹤液應儲存在4℃下，4周內有效
示蹤染料：加入染料可輔助目測觀察，在配制好的示蹤液中加入染料（60ul的染料加入到6ml的示蹤液中或是300ul染料和30ml的示蹤液）
cGMP抗血清
100dtn cGMP抗血清與6ml的緩沖液
或500 dtn cGMP抗血清與30ml的緩沖液
配制的cGMP抗血清應儲存在4℃下，4周內有效
抗血清染料：加入染料可輔助目測觀察，在配制好的抗血清中加入染料（60ul的染料加入到6ml的抗血清中或是300ul染料和30ml的抗血清）
無乙酰化的標準品和樣品的準備
1ml的緩沖液配制cGMP標準品，終濃度為300 pmol/ml，貯存在4℃下，可保存6周。
標準品準備：準備8個干凈試管，標號，吸取900ul緩沖液至1號管，2-8號管加500ul緩沖液，吸取100ul bulk標準品（300 pmol/ml）至1號管，混勻，從1號管吸取500ul至2號管，混勻，依次進行稀釋。稀釋的標準品貯存時間不能超過24h
如圖
樣品的準備：如果樣品需要純化，則根據純化步驟完成，如無需純化，則無需進一步制備。但是樣品需要稀釋來確保其濃度保持在標準曲線的線性誤差范圍內(20%-80%B/Bo)
標準品和樣品的準備----乙酰化
標準曲線的準備
用1mlEIA緩沖液重組標準cGMP，吸取100μl標準A到9.9ml的EIA中，此標準品的濃度是3pmol/ml
注意 如果樣品利用組織萃取法提取TCA，且不能用至少1:5的EIA來分析，利用乙醚萃取法提取TCA來準備標準曲線。任何稀釋的樣品需要按此方法進行
用EIA準備標準曲線： 取9個干凈試管依次編號#0至#8，吸取900μl到#0（只含有buffer)，#2至#8加入500μlEIAbuffer，吸取1ml標準B（3pmol/ml）到#1 ，然后吸取500μl到#2中稀釋，混勻后，從#2中吸取500μl到#3中，混勻，以此類推，至#8，稀釋液保存不能超過24小時
樣品準備
如果樣品需要純化，則在乙酰化之前進行純化（操作參照12-14的純化操作），雖然純化不是必需的，但我們建議將樣品純化以確保試驗的完整性。如果乙酰化的樣品少于500μl，必須加入一定體積的KOH，和適量的無水醋酸。
KOH準備
配置4M的KOH溶液，溶解100dtnKOH到10ml的超純水或者500dtn到50ml的超純水中
乙酰化步驟（建立在500μl體系中）
#0-#8中所有的標準樣品必須乙酰化，每一個樣品/標準品都必須單獨的乙酰化。確保在同一條件下進行乙酰化是很重要的，混合時間的不同或者是加入KOH的時間有誤都會影響試驗結果。
500μl的樣品，快速加100μl 4M KOH和25μl的無水醋酸，混勻器中混勻15s，加入25μl 4M KOH并混勻，對其余樣品重復相同的操作。
注意 如果樣品含糖量>250mM，則應該增加合適的KOH和無水醋酸的體積，以確保乙酰化的完全反應。
一般注意事項
檢測前樣品禁用有機溶劑進行預處理
樣品采集后需立即檢測,但在-80℃凍存的樣品需解凍,不可立即檢測.
建議布板如下:
(可根據實驗的實際情況調整布局)
注釋:每塊板條都含用2個空白對照孔(Blk),2個非特異性孔(NSB),2個最大值孔(B0). 8個標準品孔(雙份),如下圖所示:
實驗步驟
A.試劑的加入
1.EIA緩沖液
加100 μl EIA緩沖液到非特異性包被孔中(NSB),加50 μl到最大值孔中(B0).如果加入培養基樣品是為了稀釋標準曲線的,在非特異性包被孔(NSB)中和最大值孔(B0)加50μl培養基樣品,另加50 μl EIA緩沖液至NSB孔中.
2.標準品
加試管#8的50μl標準品至S8孔中.再加試管#7的50μl標準品至S7孔中.依次加入各標準品入相應的孔中.
3.樣品
依次加50μl樣品于相應各孔中,每個樣品至少有兩個稀釋比例.每個稀釋比例都做平行樣
4.酶聯物
加50μl酶聯物于相應各孔中(TA孔和Blk孔除外)
5.cGMP抗血清
加50μl抗血清于相應各孔中(TA孔和NBS孔,Blk孔除外)
微孔 | 緩沖液 | 標準品/樣品 | 示蹤物 | 抗體 |
Blk | - | - | - | - |
TA | - | - | 5ul | - |
NSB | 100ul | - | 50ul | - |
B0 | 50ul | - | 50ul | 50ul |
Std/Sample | - | 50ul | 50ul | 50ul |
用塑料薄膜(編號:400012)蓋板在室溫下孵育18h（或在4℃下孵育18h，可些許增加試驗靈敏度）
C.試驗繼續
1.臨使用前復溶Ellman’s試劑（20ml的試劑足夠加100個試驗孔）。1支100dtn的Ellman’s試劑（Cat.400050）用20ml的超純水復溶。注意：復溶Ellman’s試劑不穩定，只能即配即用且避光儲存。
2.棄去反應孔中的反應液，用洗液洗5次。
3.每個反應孔加配制的Ellman’s試劑200ul.
4.加5ul示蹤試劑至TA孔內。
5.用塑料膠片蓋板，在振蕩器上振蕩反應60-90分鐘，若在4℃，則時間約為90-120分鐘。
D.讀板
1用干凈的紙巾擦去板條底部的指紋.
2移去塑料薄膜,但避免Ellman試劑濺射
3在405-420nm處讀數.建議當B0孔的讀數在0.3-1.0 AU(減去空白孔后的值)范圍時才讀取樣本值.如果各孔的值超過1.5則應洗板,加入Ellman試劑再孵育
重測.
1. NSB孔的OD均值
2. B0孔的OD均值
3. B0均值減去NSB均值，這就是校正的B0或是校正的最大結合量
4. 計算剩下微孔的%B/B0（%樣品或標準品結合量/最大結合量）值，S1的吸收值減去NSB的吸收均值，然后除以校正B0值，乘以100即得到了%B/B0，
按此法重復計算剩余的標準品和樣品。
標準曲線的繪制
以標準品的%B/B0值為Y軸和cGMP的濃度為X軸繪制曲線，將數據代入到四參數方程式
計算每一個樣品的%B/B0值，根據標準曲線的方程式來計算樣品的濃度。樣品%B/B0值大于80%或小于20%則視為超出了標準曲線的線性范圍，需重做，同一樣品的不同稀釋比例得到的結果相差甚大，則表明有感染，需純化。