程序降溫/分步降溫（programmed freezing/stepwise freezing）
通過控制樣本的降溫速度可以盡量減少冰晶損傷和溶液損傷。降溫速度的控制可通過在不同的溫度下分階段降溫（stepwise
freezing）或者程序控制降溫（programmed
freezing）實現。與分步降溫相比，程序降溫儀通過時時調節往凍存空間噴放液氮的流量能更精準地控制樣本本身的降溫速度。比如在0—-50C液體樣本轉變為固體發生相變時會產生熱量，引起樣本的回溫，造成樣本額外傷害。程序降溫儀能夠在相變時加大降溫力度避免這一傷害。程序降溫儀在凍存精子、卵子、受精卵、干細胞、皮膚等樣本中得到了廣泛的應用，全球大約有30-40萬體外受精的嬰兒使用了這一方法。一個凍存程序通常包括慢凍、快凍等幾個階段，在凍存保護劑存在的情況下常見的凍存速度慢凍0.3-1.50C/分鐘,快凍5-80C/分鐘。在0～-400C的區間不少程序使用的是慢凍。但具體的降溫程序隨凍存樣本的不同可能有較大的差別。
玻璃化冷凍（Vitrification）
玻璃化冷凍的理論首先由Luyet提出。液體的凝固可分為兩種形式：一種是晶體化，溶液中的分子呈有序排列；另一種情況是非晶體即玻璃化，液體中的分子呈無序狀態，保持未凝固前的狀態。
正常冷凍時水容易在細胞內形成晶體造成晶體損傷，在細胞外形成晶體造成溶液損傷。但在超快速玻璃化冷凍的條件下細胞內外均呈玻璃化凝固，無冰晶形成或僅形成很小的冰晶，不致對細胞膜和細胞器不致造成損傷，細胞也不會在高濃度的溶質中長時間暴露而受損。但玻璃化冷凍所需要的超的高速降溫很難在常規實驗條件下實現。1981年Fahy提出用高濃度的冷凍保護液（玻璃化溶液）的方法大大降低了對降溫速度的要求，并與1985年由Rail和Fahy完成鼠胚的玻璃化凍存，實現這一技術的使用突破。
玻璃化冷凍是一種較新的技術，適合用于一些常規程序降溫難以處理的樣本，比如復雜的組織和器官。但對于常規程序降溫能夠較好處理的樣本（如細胞和體積很小的組織），這一技術還沒有展現出特別的優勢。正常的水的玻璃化冷凍需要極快的速度，是常規實驗室難以實現的。為了降低組織的玻璃化降溫要求，需要在樣品中加入高濃度的冷凍保護劑，常用的濃度約在40％～60％(W／V)。即使是幾分鐘的時間也會對細胞和組織會帶來明顯的傷害。所以雖然玻璃化冷凍減少了冷凍過程的冰晶傷害和溶液傷害，但在一些對比試驗并沒有表現出更好的效果，反倒是其復雜的操作帶來了不便。目前在玻璃化冷凍中，降低冷凍保護劑損傷的方法主要是使用不同冷凍保護劑的混合物和阻冰劑（ice blockers）。通過這一改進，Twenty-First Century Medicine成功將冷凍并化凍的兔腎移植到兔子體內并保持了正常功能。
急凍（Snap freezing）
急凍法通常用于保護純化的生物大分子，或者為了將來提取生物大分子的組織樣本。做法是將樣本直接放入液氮中，短時間處理之后轉移至超低溫冰箱或更低的溫度環境儲存。比較常見的例子是冷凍用于將來提取核酸的組織。這種做法會損傷大部分細胞和精細組織結構，不能用于保存樣本內細胞和組織的活性。
3 冷凍保護劑
冷凍保護劑是指可以保護細胞和組織微觀結構免受冷凍損傷的物質，通常配成一定濃度的溶液。細胞懸液中加入冷凍保護劑可保護細胞免受溶液損傷和冰晶損傷。冷凍保護劑同溶液中的水分子結合，發生水合作用，弱化水的結晶過程使溶液的粘性增加從而減少冰晶的形成．同時冷凍保護劑可以通過在細胞內外維持一定的摩爾濃度，降低細胞內外未結冰溶液中電解質的濃度，使細胞免受溶質的損傷。通常只有紅細胞、大多數微生物和極少數有核的哺乳動物細胞懸浮在不加冷凍保護劑的水或簡單的鹽溶液中，并以最適的冷凍速率冷凍，可以獲得活的凍存物。但對于大多數有核哺乳動物細胞來說，在不加冷凍保護劑的情況下，無最適冷凍速率可言，也不能獲得活的冷凍物。例如將小鼠骨髓細胞懸浮在不加冷凍保護劑的平衡鹽溶液中，并以0.3～6000C/min的冷凍速率降溫冷凍，98%以上的細胞會死亡；而加入甘油冷凍保護劑進行冷凍保存時，98%以上的細胞都可存活。
冷凍保護劑根據其是否穿透細胞膜可分為滲透性和非滲透性兩類。滲透性冷凍保護劑多是一些小分子物質，可以透過細胞膜滲透到細胞內。該類保護劑主要包括二甲基亞砜（Dimethyl Sulfoxide，DMSO）、甘油、乙二醇、丙二醇、乙酰胺、甲醇等。其保護機制是在細胞冷凍懸液完全凝固之前，滲透到細胞內，在細胞內外產生一定的摩爾濃度，降低細胞內外未結冰溶液中電解質的濃度，從而保護細胞免受高濃度電解質的損傷同時，細胞內水分也不會過分外滲，避免了細胞過分脫水皺縮。目前使用較多的是DMSO、甘油、乙二醇和丙二醇等。DMSO對細胞的滲透較快，凍存過程中保護效果較好，使用比較普遍，常用濃度是5%-10%。但DMSO本身對細胞有明顯的傷害，在40C的溫度下傷害尤甚，因此不建議樣本添加DMSO后在此溫度下長時間放置，通常與程序降溫儀或梯度降溫盒配合使用實現溫度連續勻速降低。
非滲透性冷凍保護劑不能滲透到細胞內，一般是些大分子物質，主要包括聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、蔗糖、聚乙二醇、葡聚糖、白蛋白以及羥乙基淀粉等。其保護機制的假說很多，其中有一種可能是，聚乙烯吡咯烷酮等大分子物質可以優先同溶液中水分子結合，降低溶液中自由水的含量，使冰點降低，減少冰晶的形成；同時，由于其分子量大，使溶液中電解質濃度降低，從而減輕溶質損傷。
不同的冷凍保護劑有不同的優缺點。目前的趨勢是聯合使用兩種以上冷凍保護劑組合。由于許多冷凍保護劑在低溫條件下保護細胞，在常溫下對細胞有害。故在細胞復溫后要及時清除冷凍保護劑。