Vero 細胞在 WAVE 反應器中的微載體球轉球放大
陸麗芳，Christain Kaisermayer, 姚鈺舜，隋禮麗
通用電氣醫療集團生命科學部，Fast Trak研發中心，上海
概要
Vero 細胞能被廣泛應用于疫苗的生產。Vero 細胞的培養技術能否成功放大對于該技術能否大規模應用于疫苗生產至關重要。作為貼壁細胞，我們的經驗證明Vero 細胞能夠成功地用微載體技術在 WAVE 反應器中生長。為了進一步尋求放大培養的可能性，我們在 WAVE 反應器中進行了細胞從微載體 Cytodex 1 上的球轉球實驗。一系列的實驗都相當成功。Vero細胞首先在 10 L的培養袋中用Cytodex 1微載體培養到一定密度，生長在微載體上的細胞隨后用胰蛋白酶消化，經消化后基本脫離微載體的細胞最終和舊的微載體根據一定的傳代密度轉移到新的微載體培養體系中并開始新一輪細胞培養。我們的結果顯示，幾次這樣的轉移傳代前后，細胞的生長速度基本一致。Vero 細胞的微載體培養技術在 WAVE 反應器中放大完全可能。進一步的實驗顯示，在現有的工作條件下，Vero細胞在 Cytodex 上的培養以及球轉球工藝可以達到 10 倍的放大倍率。這為基于細胞培養的疫苗大規模工業化生產新前景提供了可靠的支持。
前言
Vero細胞最初起源于非洲綠猴腎，已知對多種病毒如 SV40、 SV-5、 麻疹病毒、蟲媒病毒、呼吸道腸道病毒、風疹、猿腺病毒、脊髓灰質炎病毒、流感病毒、副流感病毒、牛痘病毒等等，都敏感。Vero 細胞因而被廣泛應用于針對相應疾病的疫苗開發[1]。最近針對流感疫苗的開發就使用到了 Vero 細胞[2]。知名的制藥企業百特公司（Baxter Healthcare)成功利用 Cytodex3 型微載體進行 Vero 細胞流感疫苗的生產，使用 3 級不同的發酵罐進行微載體球轉球擴增，最終至 6000L 反應器的培養規模。諾華公司也早已在其歐洲的細胞培養工廠中得到許可使用細胞疫苗生產技術。諾華公司最近與美國衛生與公共服務部（HHS)達成協議，后者贊助前者 4.86 億美元在北卡羅來那建立哺乳動物細胞疫苗生產基地，計劃 2012 年投入使用[3]。細胞疫苗技術，具有快速和可靠的特征，作為全球發展的大趨勢，將有望逐步替代目前的雞胚疫苗技術。
作為貼壁細胞，Vero 細胞需要生長于一定的表面，在小規模狀態下可以用 T 型培養瓶或滾瓶來進行培養。國內微載體細胞培養水平和國外差距較大，多數仍使用轉瓶/細胞工廠直接接種到 30L 發酵罐中，采用多個 30L 發酵罐平行放大操作。轉瓶培養屬于勞動密集型操作，無法對 pH、溶氧等參數進行精密控制，同時具有較高的污染風險。多個小型發酵罐的平行放大無法避免每個反應器之間的差異，增加了生產過程的控制點，不利于產品質量的穩定性和整個生產工藝的驗證，限制了產能。
因此需要開發大規模微載體細胞培養技術以滿足生物技術發展的需要，而微載體球轉球放大工藝就是其中的關鍵點之一[4,5]，以便在更大的工業規模進行培養和生產。衡量這一技術是否成功, 一方面固然是轉移是否成功，同樣重要的另一方面則是轉移后細胞是否能有同樣的生長狀態。
方法
WAVETM 反應器中 Vero 細胞的培養
在10升的細胞培養袋中，Vero在微載體 Cytodex 1 (Cyt.1)上貼壁培養，微載體濃度是 3-6g/L,懸浮培養體積 1.5-3L。在接種前一天，細胞培養袋預先被放置到WAVETM 反應器上，充滿 10% CO2,并加入 70-90%培養體積所需的培養液以及微載體，并在 37°C 搖動過夜以便使溫度和 pH 得到充分平衡。接種當天，用胰酶把細胞從細胞工廠中消化下來，重新懸浮于新鮮的培養基中并轉移到預先平衡的細胞培養袋中，細胞接種密度控制在每毫升 3-5x105個細胞。培養條件是，搖速 11 rpm，角度 4 度，溫度 37°C。pH 控制在 7.0-7.3 之間。根據葡萄糖的代謝情況適時通過用新鮮培養液替換培養袋內的培養液來補充營養。每天采樣監測細胞生長速度和狀態。
細胞計數的方法是，用含檸檬酸的結晶紫染色液破碎細胞，釋放并染色細胞核，通過在顯微鏡下計數細胞核來確定細胞的數量。微載體上的細胞形態則通過固定，蘇木素染色和顯微鏡來觀察并照相。細胞密度達到約每毫升2-3x106個時，進行球轉球實驗。每次球轉球實驗后，細胞在WAVETM 反應器內用上述同樣的方法進行數天的培養，觀察生長狀況。