在瓶子內進行球轉球實驗
在 WAVETM 反應器內細胞密度達到需要的水平時,Vero 細胞微載體培養懸浮液即被轉移到另外一個透明的瓶子中并移到生物安全柜中。后面的清洗和胰酶消化過程等均在生物安全柜內進行。在微載體沉降下來之后,去除上清。剩下的微載體被轉移到 500 毫升無菌透明的瓶子內(這是根據 2 升培養體積所需的瓶子大小,不同的情況應有不同的需求)。盡量多地去除上清。加入 400 毫升 37°C 預熱的含 0.02% EDTA 磷酸緩沖液 (PBS-EDTA), 適當混合,待微載體沉降后去除上清。以上同樣的過程重復 3次以使微載體得到充分洗滌。
長有細胞的微載體在用 PBS-EDTA 充分洗滌之后,即用含 0.02% EDTA 的 0.25%胰酶消化。2 升的培養體積(6 克微載體),胰酶用量為 300 毫升。胰酶預先在37°C 預熱,在與微載體混合之后置于 37°C 中并每隔 10 分鐘進行一次充分的混合。25-30 分鐘之后,根據所需要的接種密度和稀釋倍數,取一部分細胞-微載體-胰酶混合懸浮液到一個干凈的無菌轉移瓶內,與新鮮培養基混合并接種到一個新的培養袋中開始新一輪的培養。在 WAVETM 培養袋內進行球轉球實驗
在 WAVETM 反應器內細胞密度達到需要的水平時,球轉球實驗在 WAVETM 培養袋內進行。實驗開始前,準備裝有 5-10 升 PBS-EDTA 的液體轉移瓶和溶積 5-10 升的廢液瓶,滅菌。準備 1 升的液體轉移瓶兩個,滅菌,并在無菌條件下分別裝入胰酶和新鮮培養基。將 PBS-EDTA,胰酶和新鮮培養基分別預熱至 37°C。
在無菌條件下(如無菌管道焊接機)將這幾個瓶子與細胞培養袋接通。整個實驗過程中細胞培養袋均被置于反應器上。反應器停止搖動并停止加熱以防過熱或不均勻加熱。培養袋內長有 Vero 細胞的微載體會在數分鐘內沉到底部。用泵把盡量多的上清液移至廢液瓶。加入一定量的 PBS-EDTA,輕柔混勻后,再次沉降微載體并移去上清。如此重復三次,每次使用 PBS-EDTA 的量不超過一個培養體積。
長有細胞的微載體在用 PBS-EDTA 充分洗滌之后,與 37°C 預熱的含 0.02% EDTA 的 0.25%胰酶混合,在微載體密度為 3g/L 時,胰酶的用量為 15%培養體積。胰酶的用量可根據實際情況作調整。加入胰酶后的混合液每 10 分鐘輕柔搖動混合一次。25-30 分鐘后,細胞培養袋內的懸浮液被轉移至一個空的無菌轉移瓶內。用少量新鮮培養液淋洗培養袋一次并和前面的合并。根據所需要的接種密度和稀釋倍數,接種新的細胞培養袋并開始新一輪培養。
結果
在細胞培養袋中和外部瓶子中進行的球轉球實驗結果比較
這里有三次球轉球實驗(B2B #1, #2, #3)。其中一次球轉球實驗(B2B #1)在培養袋外的瓶子中進行,另兩次(B2B #2 和#3)在 WAVETM 培養袋內進行。第一次(B2B #1)和第三次(B2B #3)實驗的 Vero 細胞來自通過細胞工廠接種到培養袋中并生長起來的細胞,而第二次實驗 (B2B #2)的 Vero 則直接來自第一次球轉球實驗后接種并培養起來的細胞。這幾次實驗我們均是在細胞密度超過 2x106時進行球轉球,并把
放大倍數控制在 5-6 倍。表 1 列舉的是這三次轉移的大致情形。在第一次轉移之前,細胞首先從細胞工廠接種到 10 升的培養袋內并培養生長到所需要的細胞密度。經過球轉球之后的細胞培養也是在 10升的培養袋內進行。
表1.各次球轉球實驗情況
每次球轉球前后的細胞生長情況都通過每天采樣來監測。圖 1 和圖 2 顯示的就是根據每次培養每天細胞密度的增長情況繪制的細胞生長曲線。我們把相關聯的放在一起做比較。其中圖 1 顯示的是 B2B #1、B2B #2 之前和之后細胞生長曲線,而圖 2 則顯示的 B2B #3 之前及之后的細胞生長情況。我們可以看到在各次球轉球實驗前后,細胞都保持著良好的生長活力。在球轉球實驗之后,因起始細胞密度相比初始種子培養的稍低,因此需要多一天時間達到相似的細胞密度。總體來說,細胞生長的速度基本相同。
圖1.球轉球實驗B2B #1和 B2B #2前后細胞生長曲線
圖2.球轉球實驗B2B #3前后細胞生長曲線