前 言
基因的變異類型有多種，對應的分子檢測方法亦有多種，當前資本市場驅動著分子檢測市場，并極力追捧NGS技術，因為其通量高，靈敏度高且性價比高。小編承認NGS是分子檢測的必然發展趨勢，但是短時間內，NGS并不會取代其他分子檢測方法，因為針對不同的需求，都有對應的理想檢測方法，每個檢測平臺都有著自己的優勢，比如：
操作簡單：PCR，ARMS-PCR，HRM等
時間快速：ARMS-PCR，HRM等
成本低：PCR，PCR-RFLP，MassARRAY等
準確：Sanger等
通量高：NGS等
靈活性：Pyrosequencing等
結果分析簡單：ARMS-PCR等
自動化：核酸提取等
......
小編一直認為：沒有最好的技術，只有最合適的技術！最好的，不一定是最合適的；最合適的，才是真正最好的。
今天，我們聊一聊PCR-RFLP技術，上一篇我們已經介紹過PCR電泳技術，兩者主要原理類似，只是實驗中多了一步“限制性內切酶的剪切”，首先，我們先了解下什么是RFLP技術？
RFLP：限制性片段長度多態性（Restriction Fragment length Polymorphism，RFLP），是一種基于PCR擴增和限制性內切酶特異識別序列并切割的基因分型方法。該法不依賴自動化設備，是實驗室對較少量的標本進行基因分型的實用方法。
限制性內切酶通常可以特異性識別雙鏈DNA的某一段序列，并在特定位置或附近進行DNA雙鏈切割，進而產生短的DNA片段。由于限制性內切酶識別序列的嚴格性，識別序列發生一個堿基的變化都使得酶切位點不能被酶切，從而保持原有序列長度（原理見下圖）。
Pst I酶的識別序列和酶切切口
RFLP法用于基因分型時，限制性內切酶的識別序列選擇主要依據SNP位點上的已知等位基因，根據待測的SNP等位基因和位點附近序列，查找符合序列的限制性內切酶。設計引物擴增含有SNP位點的DNA片段。當限制性內切酶與PCR產物共同孵育時，該酶將僅識別一個等位基因（野生型或變異型），然后在該位點切割DNA分子。依據個體攜帶的等位基因不同，酶切可以產生不同的切割片段，應用凝膠電泳，通過DNA片段大小判斷SNP基因型。
RFLP檢測原理
RFLP法應用實例介紹
比如現在需要研究柔紅霉素藥物濃度的相關基因，擬選擇對ABCC1 基因的Arg723Gln位置進行檢測分析（2168G>A, rs4148356 ）。（今天的實例比較有特點）
daunorubicin濃度與Arg723Gln關聯性
當我們知道需要檢測的位點后，RFLP的檢測流程大致分以下三步：
1，選擇合適的限制性內切酶，該酶能夠特異性識別SNP位點的堿基種類，當SNP位點堿基變化時，能夠使該酶失去原有的識別位點；
2，設計擴增引物，將包含SNP位點的一段DNA擴增下來，且保證其中只有一個該酶的識別位點；
3，使用限制性內切酶對產物進行酶切、電泳，通過產物帶型來確定SNP的堿基種類。
首先，通過NCBI查找rs4148356位點的序列，選擇合適的限制性內切酶；并在UCSC數據庫中下載ABCC1基因序列，準備下一步引物設計。
rs4148356位點的序列找出后，我們在WatCut（SnapGene軟件可能更直觀）軟件中查找此位置的內切酶，可惜并沒有找到合適的位點內切酶（見下圖）。
Arg723Gln的限制性內切酶選擇
我們知道RFLP的技術方法不能適用于所有SNP位點分型，因為并非所有SNP位點均能找到合適的限制性內切酶，那么Arg723Gln是否可以用RFLP來檢測呢？答案是可以的，接著往下看。
如果沒有合適的酶切位點，我們是否可以將引物設計在酶切位點附近，并在引物上做一些修改呢？于是，我們先設計引物，并使上游引物的3’端靠近檢測位置，3’端堿基不能修改，因為Taq DNA酶必須在引物3’末端與模板完全互補情況下才能進行有效的聚合反應，那我們在倒數第二個堿基位置進行修改（下面中綠色的C位置），將C變成T，以期找到合適的內切酶。（產物長度為150~1000bp，且酶切位點左右序列長度差異＞100 bp以保證電泳帶型明顯）
Arg723Gln的引物修改
修改完成后，我們再次將序列導入WatCut軟件中查找內切酶，可以發現此時出現了我們需要的內切酶，此時我們可選擇Ags I酶和Taq I酶都可以，因為我們修改過一個堿基，此時選擇Taq I酶進行實驗，因為Taq I酶剪切T CGA位置：
引物修改后出現可選擇內切酶
為了驗證此RFLP方法是否可行，檢測結果將RFLP法與Sanger法進行了對比（見下圖），如果是野生型，那就是T CGA，可以被Taq I酶剪切，結果便會出現132bp及25bp兩條帶；如果是純合突變型那就是T CAA，不可被Taq I酶剪切，結果便會出現一條157bp條帶；如果是雜合突變型，那就是T CGA和T CAA共存，一半可被Taq I酶剪切一半不可被Taq I酶剪切，結果便會出現132bp、25bp及157bp三條帶。通過PCR-RFLP法便可準確的進行Arg723Gln的檢測。（今天的實例比較特殊，有些SNP的位點很好選擇限制性內切酶的）
RFLP法與Sanger法
整個實驗主要操作步驟
PCR-RFLP檢測技術點評
優點：
1，操作簡單；
2，無需探針標記；
3，實驗設備比較普及；
4，成本低。
缺點：
1，通量低；
2，部分SNP無合適限制性內切酶；
3，部分結果不容易判斷。
4，時間較長，目前市場較少見。
此方法適宜于硬性條件不好的實驗室進行低通量的分子檢測。