我們用高光譜成像來量化與EGFR行為有關的納米粒子散射變化(圖 3, a-i)。高光譜成像要求使用PARISS系統 (Lightform公司)。散射的巔峰在530-550 nm之內的圖像采集于4 ?C 條件下(圖 3d)：在這種條件下，EGFR明顯位于細胞質的膜上。在25 ?C時隨著EGFR主要集中在早期胞內體時紅色漂移開始增多(圖 3e)。然而在37 ?C時寬譜波段的巔峰位置很明顯(圖 3f)。在4 和 25 ?C(圖 3g 和 h)，波峰分布的平均值和標準差分別為546 ±15 和 574 ± 20 nm。有趣的是，在37 ?C (圖 3i)散射光譜的波峰有很大程度的偏移（平均值和標準差為597 ±44 nm）；這與細胞內存在EGFR多樣機制和交易階段是一致的。
圖3. 綁定金納米粒子EGFR的散射與EGFR調控階段之間的定量關系。在4 ?C (左邊, a,d,g), 25 ?C (中間, b,e,h), 和 37 ?C (右邊, c,f,i)標定細胞的暗場高光譜顯微。用圖1中描述的顯微裝置來獲取數據。在細胞圖像中代表性的單像素光譜顯示了在大約 546 (a), 576 (b)和 601 nm (c)散射的波峰。(d-f)圖像是根據視場范圍內每一個像素的散射波峰位置標定的顏色。如果一個像素沒有可以辨認的波峰與光譜相對應的像素，就不給分配顏色。(g-i) 顯示了(d-f)中頂峰散射波長的分布。(j-l)為下面三個典型結構是納米粒子聚合物光譜的電動模擬：一個4-粒子的鏈狀結構(j,m)、一個19-粒子的盤狀結構(k,n)，一個130-粒子的卷裝結構(l,o)。全部的散射截面都標給每一種結構標繪的，旁邊附帶相應的粒子分布細節(m-o)。受有效粒子數目增長的影響和從二維到三維的形態變化的作用產生了明顯的紅色漂移和散射光譜的增寬。
金屬納米粒子聚合物光散射電動模型
為了進一步發掘納米粒子聚合物形態與聯合光學截面之間的關系，我實施詳細的電動模擬。用于計算納米聚合模擬的電動代碼是完全應用基于C++的部分新型T矩陣代碼，它是在過去的幾年中被開發出來的。自始至終都使用混合的多線程的信息通道截面(MPI)工作模型，采用最佳的現代群組計算資源。具體的擴展至聚合物的T-矩陣構架主要基于Mackowski, Mishchenko41-43 和 Stout44探討的方法。介電常數函數的細節在Aaron et al上有陳述。在所有的實驗中入射光都是非偏振的，波動矢量像圖 3m-o一樣指向頁面。金球體直徑為25nm，由水環繞，粒子中心間隔為2.4倍粒子半徑。粒子的3D理想晶格點分布的小數標準偏差為0.07。每一個聚合形態都用TEM圖像中描述的聚合顆粒的數目、顆粒空間、以及整個形態的典型值來構造。
納米粒子聚合物的光學反應復雜非線性地依賴聚合物的形態細節，而且很大提高光學截面群集粒子數量的變化29,40。聚合物的形態細節可以顯示受體/納米粒子的數量、空間和總體的空間分布（比如二維平面或者三維立體結構）。通常情況粒子間耦合的影響會產生一個紅色漂移和諧振波峰的變寬。圖3(j-l)顯示三種典型結構(圖 3m-o)的散射橫截面，這三種模型被設計成近似聚合物形態，圖2d-f。注意的是模擬光譜顯示總體紅移和波峰增寬，與圖3a-c描述的一致。
對于隨機的聚合物，由于在粒子空間內高位非線性地依賴等振粒子共振耦合，所以粒子位置平均值波對光譜漂移有明顯影響。而且像那些在胞內體看到的三維volume-filling 比二維聚合物經歷著更多的光譜漂移。這是值得關注的，因為它說明NPRC可以探測到形態上面的差別與內化作用有關，這種內化作用是由相應納米級別EGFR組織的變化導致的。
監視EGFR交易
既然已經建立了綁定納米粒子的EGFR散射性質與EGFR的調控階段之間的關系，我們檢驗三基色圖像等級也可以有效地用來監視EGFR交易。活細胞顏色圖像的紅帶相對強度出現增長(圖 1, B)是EGFR激活和內吞作用的一個明顯標志。因此，我用這個參數將活細胞圖像顏色變化與EGFR的控制階段聯系起來。為了達到這個目標，圖3提供的高光譜數據被分成三個類別，分別對應相關聯的EGFR的調控階段。（1）表皮受體，（2）早期胞內體，（3）晚期胞內體/MVB。每組至少要分析5個完整的細胞被，每組至少代表1000光譜。用得出的結果光譜被來為每一個EGFR區域標準化紅帶強度值獲得統計上的明顯的區域分布（圖4）。然后對每一個無背景像素的延時圖像，我們分析標準紅帶值屬于每一個相關EGFR階段的幾率。這些成對的比較導致3個假定值，在為活細胞圖像每個圖像設定偽色時這些假定值被用作權定因數。這個分析可以形成圖像，在圖像中顏色代表著EGFR控制階段的統計概率(圖 5)。
圖4.標定金納米粒子EGFR分子的相關紅帶強度分布——細胞表面（藍）、早期胞內體（綠）、后期胞內體（紅）
