前序列篩查
使用HRMA進行前序列篩查,特別是對于大基因可以節省很大的成本;Provaznikova
等[2008]報道對于MYH9基因可以避免85%的測序。在例中的DMD基因,第79個外顯子需要分析(Al-Momani
等),假定每個外顯子測序需要10歐元,篩查一個患者總共需要800歐元。每個外顯子PCR花費1歐元,HRMA染料花費0.1歐元,每個患者估計花費90歐元。假定序列分析需要5個外顯子熔解需要分析(包括一個致病突變,三個非致病突變和一個假陽性)需要增加50歐元,總花費為140歐元。每名患者將節省650歐元,當使用熔解探針去確定常見非致病突變存在時,將會減少更多的花費。事實上,基于這些圖,五個外顯子基因的HRMA預篩查已經很劃算。此外,檢測體細胞的變化或異質性[Dobrowolski
等.2009],HRMA比測序似乎更靈敏。
SNP分型
HRMA用于SNP分型有很大的吸引力。實驗設計廉價、簡單、速度快。當在一個特定區域設計一到兩個PCR覆蓋一個SNP,至少一個通常兩個將得到很好的結果。提高靈敏度,片段必須夠小(80-100bp),當可以選擇時(比如:在單倍體中)應選擇G-A突變(預計得到最大的熔解變化)[Reed
和Wittwer, 2004]。推薦添加非標記探針[Nguyen-Dumont 等, 2009; Zhou
等,2008],得到了雙重檢測同時提高了純合子突變檢測率。當設定的引物到達時,不用做一到兩次的
PCR去摸索擴增條件。檢測成本僅僅PCR費用,實驗設計花費可以忽略。除非有大量的樣品需要分型,染料成本相對于實驗成本包括具體的標記探針(例如,TaqMan)而言比較低。HRMA樣品吞吐量可以通過使用自動進樣板增加,在一些系統中可用一些延伸或安裝一個附加的進樣器。
根據上面描述的陽性結果是否重復可變數目,特別是CA重復,可以被HRMA分型(圖4)。雖然樣品所有的熔解曲線可以清楚地被區分,我們發現所有可能結合的等位基因很多,所以雜合子CA重復分型不能準確確定。可以通過小的家族去檢測家族成員間的差異同時研究雜合子樣品的雜合性(LOH)缺失。正如Intemann等[2009]的實驗結果,可以推測熔解探針的添加跨越最小的或最大的等位基因可以更大的增加分辨率。
HRMA的一個缺點是不能輕易應用使用多重模式,同時進行幾個不同片段同時分型突變。按理來說,可以利用顏色差異,溫度差異完成多重模式。Seipp等[2008]利用最簡單的方法,Tm差異成功地設計了一個四倍體基因分型實驗。然而,這些設計時間多少和成功決定于高質量的DNA樣品和HRMA系統的靈敏度使用。
圖4. 使用HRMA分析CA重復。 六個不同DNA樣品重復分析,所有的都是雜合子。上圖:歸一化溫度變化熔解3=14/17,4=14/18,5=15/21,6=14/21。
甲基化
目前,基因組研究經常涉及表觀遺傳學標記,尤其是CPG二核苷酸在基因表達、印記和腫瘤的甲基化(Ehrich等2006)。這些程序關鍵的步驟是基因組DNA的處理,不斷改變的非甲基化C核苷酸(不是甲基化Cs)到我們。HRMA可以應用在這些研究中的兩個階段。首先,成功治療的前后可以通過控制的基因組片段的PCR檢測,沒有甲基化的CPGs和100%甲基化樣品樣品的熔解曲線。越接熔解圖近類似于片段100%的轉變,治療后越好[Worm等.2001]。其次,HRMA可以用于確定C-U轉變的百分率,直接用于熔解探針的結合[Maat等.2007]或克隆后。
量化— 確定鑲嵌性和拷貝變異數量
根據熔解曲線變化,HRMA可以用于量化分析;較大的變化、較小的差異可以被檢測到。確定突變分子數量常用的技術為雙氧法測序(分辨率下限為20-30%)和焦磷酸化測序法(下限為1-10%)。雖然功能強大,焦磷酸測序法是一種勞動密集、昂貴同時需要專門設備的方法。我們成功的應用HRMA確定不同等位基因的數量[Aten等,
2009; Bruder等,
2008],同時顯示檢測12.5%的步驟(1/8)通常是可以的[Aten等2009]。結腸癌中體細胞檢測的應用見圖5。使用稀釋系列作為一個標準,可以快速確定三個疑似攜帶致病突變患者的體細胞嵌合體水平達5-10%。這些數據和通過焦磷酸測序獲得的結果完全吻合[Hes等,2008]。然而檢測費用低廉同時易于操作。應當指出當使用熔解探針時分辨率會提高到5%以下。等位基因表達差異確定的其它應用,基于突變在mRNA中的存在和mtDNA雜合子的檢測[Dobrowolski等,
2009]。
圖5.使用HRMA量化。A:在APC第8外顯子非致病突變A>G稀釋系列。B:三個馬賽克樣品的HRMA曲線。下圖:衍生圖。等位基因長度為:1=18/21,2=17/21 圖像重疊(S1-S3)和體細胞嵌合體水平的估計。 樣品的焦磷酸測序估計分別為:30%、19%和7%
目前,我們使用相同的方法研究一對雙胞胎細胞攜帶體細胞缺失的片段。[Bruder等,
2008]。當篩查患者基因組改變相關疾病時,采用該方法也可以用于確認CNVs(缺失和重復)。根據不同的設置,像FISH、MAPH
[Armour等, 2000], MLPA [Schouten等, 2002], MAQ [Suls等, 2006], 和 qPCR
技術可以用于確認陣列結果。然而這幾項技術要么成本昂貴要么需要進一步的發展。任何可疑區域的SNP都可以使用HRMA確認。這些純合子樣品對于的等位基因(AA和BB)和潛在的攜帶變化的樣品1﹕1混合。假定檢測樣品攜帶了A等位基因,要么是AO,要么是AA。當與純合子BB樣品1:1混合,缺失確定時,熔解圖樣品AA:BB以1:2的比例混合(AOBB)。當樣品AA:BB以1:1比例混合時,缺失不存在
(AABB)。當1:1純合子樣品BB樣品 與3:2 AA: BB樣品混合(AABB)。