外顯子14：多重探針分析
主要實驗的外顯子14，
兩個野生型的探針同時用于一個反應，用來檢測所有已報道的外顯子14的突變，同時消除密碼子836（p.S836S）多態性（圖4；a和b；表3；補充表5；http://jmd.amjpathol.org）。WT14A探針在65℃-76℃檢測密碼子804和806突變，反之，WT14B探針在76℃-85℃檢測密碼子844和852序列變化。WT14A主要探針檢測的序列變化，第二次基因分型實驗用3個特定突變探針（MS14A探針集1；圖4；c-e）。例如：密碼子804（GTG→ATG）突變等位基因通過比野生型等位基因高的Tm值基因分型。野生型等位基因與MS
480 ATG探針（表4c）互補且被不互補的MS 804 TTG和
CTG探針遮蔽（圖4，d和e）。除了不互補遮蔽之外的所有需要檢查的密碼子480突變等位基因，特定突變探針與野生型等位基因有相同的Tm值。設計MS
844 CTG和MS 852 ATG這兩個探針，來檢測在主要WT14B探針下的已知序列變化（沒有顯示數據）。
外顯子16：主要特定探針
因為95%的MEN2B事例有RET外顯子19密碼子918（ATG→ACG）突變引起的，外顯子16主要實驗用一個特定突變的探針，密碼子918突變等位基因的Tm值高于野生型等位基因（△Tm-5.6；表4f），擴增子數據證實從野生型控制偏移（沒有顯示數據）。密碼子922序列變化，在探針下，密碼子912稀有突變在擴增子之內，不能用于測試。
圖4：外顯子14和16內的突變的基因分型。a：在一個反應中的兩個野生型外顯子14主要實驗探針數據生成的派生熔解曲線圖。WT14A探針數據的溫度范圍是65℃-76℃，WT14B探針數據的溫度范圍是76℃-85℃。一式兩份顯示三個野生型對照（黑色痕跡）、密碼子804（GTG→ATG）（深灰痕跡）（GTG→TTG）（淺灰痕跡）兩個雜合突變樣品。密碼子804（GTG→TTG）突變不可用。圖表中所用的顏色是一致的。顯示標記的突變等位基因（MUT）和WT等位基因的派生熔解溫度范圍。b:用材料和方法描述的額外的標準化和指數背景移動，數據與a相同。c-e：和b一樣的分析圖。第二次實驗中用MS14A探針集1中的三個探針檢測突變樣品：MS 804 ATG （c），MS 804 TTG（d）和MS 804 CTG（e）。和WT等位基因一樣標記互補密碼子突變DNA序列，且遮蔽突變等位基因（遮蔽“密碼子DNA序列”MUT）。f：外顯子16密碼子918特定突變探針（MS918ACG）主要實驗數據的派生熔解曲線圖。一式兩份顯示三個野生型對照（黑色痕跡）、密碼子918（ATG→ACG）（灰色痕跡）兩個雜合突變樣品。突變等位基因與WT等位基因一起標記。
盲研究
在RET外顯子基因分型實驗中，測試5個野生型樣品和29個可用的RET序列變化盲樣品組合（補充表6；http://jmd.amjpathol.org）。在主要實驗中把不同于19野生型外顯子的59個RET序列變化基因分型。另外，外顯子13多態樣品的純合與雜合樣品，以及外顯子16密碼子918（ATG→ACG）突變，在主要實驗中基因分型。探針和擴增子數據結果是一致的。不論第二次實驗通過Tm標線選擇或計算每個樣品的△Tm值，之后用△Tm數據表選擇特定突變集合，外顯子10和11的結果相同。對于每個突變，基因分型只需2-5個探針，且不需要測序。第二次實驗基因分型主要實驗檢測到的主要RET序列變化。雖然主要實驗檢測到外顯子11密碼子631序列變化樣品，第二次實驗并沒有設計用于此為點基因分型的特定突變探針，且只有這些樣品需要測序進行基因分型。
討論
雖然測序是RET基因分型的標準，突變掃描是比較劃算的，因為測試的大部分外顯子是野生型的。檢測不定時發作骨髓甲狀腺癌病人的RET突變，然而實際上只有10-25%的病人有生殖細胞RET突變。此外，因為MEN2是常染色體顯性紊亂，MEN2患者在一個外顯子有一個RET突變，其它外顯子是野生型（或有多態）。MEN2病人的親屬一般測試RET突變且可能在一個外顯子有突變或所有測試的外顯子都是野生型。假設33%的測試MEN2突變的病人實際上在檢測的5個外顯子中有一個外顯子有一個RET生殖突變，則測試的外顯子的93%是野生型或不致病多態基因型。
擴增子高分辨率熔解分析可以檢測100%的RET序列變化。雖然擴增子高分辨率熔解分析可以區分獨特的雜合子，但是很多RET基因型不能區分出來，因為不同的序列變化有相似的擴增熔解曲線。添加非標記探針可以在相同的熔解數據上分析擴增子及探針數據。但是，有一些RET突變在野生型非標記探針存在反應的情況下仍不能區分。比如：RET突變
“TAC”可以在密碼子618或620中發現，每個突變導致差不多的探針熔解，因為野生型探針覆蓋兩個突變，且最近的堿基是相同的。
為了用最小數目的非標記探針及反應完成RET突變的基因分型，發明了一種連續的兩步法，包括主要實驗和第二次實驗。主要實驗通過擴增子熔解檢測引物間的突變，用非標記探針法分析RET突變熱點。主要實驗用到的大部分探針式野生型序列。外顯子特定突變探針是個例外，其與密碼子918普通
MEN2B突變互補（95%MEN2B情況）。另外，用遮蔽技術設計的主要外顯子13探針用于明顯的區分普通密碼子769（CTT→CTG）多態和密碼子768突變。在主要實驗中，用7個PCR反應和8個探針，講RET外顯子（93%）大多數基因分型為野生型。這個主要實驗同時也基因分型外顯子16密碼子918（ATG→ACG）突變。
用已發布的每個MEN2綜合癥密碼子突變的頻率及每個MEN2綜合癥的平均發生率來評估主要實驗探針檢測的RET突變的百分率：MEN2A，75%；FMTC，20%；MEN2B，5%。外顯子10、11、13、14和16的探針檢測已報道的MEN2突變的98%。外顯子MEN2A和FMTC突變主要在密碼子634，且MEN2A病人最普通的突變在密碼子634（TGC→CGC）,其頻率為50%。在探針分析區域之外有稀有突變（表1），這些突變只通過擴增子熔解分析檢測，之后進行測序。第二次實驗用于基因分型主要實驗探針檢測的RET序列變化。PCR反應的第二步需要由主要實驗探針數據選擇的2至4個特定突變探針，基因分型每個樣品。外顯子10和11需要位置探針檢測密碼子的突變，因為外顯子10和11的特定突變探針在每個致病密碼子上有相同的突變核苷酸改變。只由擴增熔解分析檢測到的稀有序列變化，或主要探針檢測到的序列變化沒有被第二次實驗探針進行基因分型的突變均需要測序，需要測序的RET外顯子少于0.2%。
