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  • 發布時間:2020-07-13 16:30 原文鏈接: 應用非標記探針法進行基因分型(七)

    一般來說,用特定突變探針產生1/3結果。首先,當突變序列與特定突變探針互補時,突變等位基因的熔解Tm要高于野生型(△Tm為-2℃至-5℃)。第二,當突變在相同位置但是與特定突變探針序列不互補時,突變等位基因被野生型等位基因相似的Tm值及穩定性所遮蔽(野生型等位基因Tm±0.5℃)。在這種情況下,沒有互補的突變及野生型等位基因與探針在同一位置有一個錯配,但是錯配的精確的核苷酸形式是不一樣的。遮蔽等位基因Tm值與野生型等位基因Tm值的接近程度取決于錯配序列,其它與探針錯配的數目及互補核苷酸周邊的環境。例如:A::G錯配突變等位基因比A::C錯配野生型等位基因熔解溫度高2℃(表2b,TAC突變和MS618/620TCC探針)。不管突變密碼子序列改變在RET密碼子618、620或609(611不能用于測試),結果都適用。第三,當突變在特定突變探針序列改變的不同位置,突變等位基因和探針有另一個錯配且熔解Tm值低于野生型等位基因(△Tm為0.5℃至5℃)。如果從第二次實驗選擇的探針集內的特定突變獲得結果,序列變化在探針下的突變位置未知,不能基因分型。在第二次實驗中沒有進行基因分型的樣品需要測序(比如:外顯子11密碼子631序列變化)。

    用遮蔽技術設計了6個探針用來簡化復雜范圍的分析。遮蔽技術在選擇的序列變化的位置人工錯配,使探針其它突變的分析變得簡單。主要實驗的外顯子13遮蔽探針(遮蔽 1bp 769)和外顯子13的兩個特定突變探針在密碼子769(CTT→CTG)多態位置有一個核苷酸缺失,這可以清晰的檢測和基因分型密碼子768(GAG→GAC和GAT)的兩個突變。外顯子10和11的3條位置探針分別用三個核苷酸的缺失(密碼子)來遮蔽一個致病密碼子范圍。位置探針用來鑒定探針下突變密碼子的位置,減少了第二次實驗中需要的特定突變探針的數據的1/2。

    可能已知RET突與其它已知或未知突變是順或反的意思,比如說在外顯子14(密碼子804和806突變)或外顯子13(密碼子791突變與密碼子769多態)。對于探針數據,如果兩個核苷酸在同一等位基因上改變,預期其Tm值低于任一突變。如果核苷酸在相反的等位基因改變,這兩個等位基因的Tm值低于野生型,樣品似乎是純合突變。在這兩種情況下,樣品需要測序,因為任何一個變化的等位基因不在預測的RET突變的△Tm范圍內或在第二次實驗中沒有識別基因型。如果第二個核苷酸改變不在探針下但是在擴增子之內,可以從RET突變基因分型的探針數據看到一個獨特的擴增子派生曲線形狀或低的Tm值便宜。這種情況很可能是外顯子13(例:密碼子791突變和密碼子769多態)。當用外顯子13擴增數據分析外顯子13主要探針實驗不能分析的稀有突變時,需要考慮由探針數據決定的普通密碼子769(CTT→CTG)多態的存在。如果樣品是WT13探針數據確定的野生型序列,如果擴增曲線從野生型對照偏移,應該測序樣品檢測稀有突變。如果WT13和Mask 1 bp 769 探針數據顯示普通密碼子769(雜合或純合)多態,如果擴增曲線從769多態對照熔解曲線上偏移,需要測序樣品。雖然非常稀有,RET突變可以是純合的。如果這樣的話,兩個等位基因可以與合適的特定突變探針互補。

    表1列出的是已報道的用RET基因分型實驗分析的外顯子10、11、13、14和16的MEN2突變、多態和序列變化。外顯子15和8及最近報道的外顯子5的沒有包括的極其稀有的MEN2突變,可以通過測序這些外顯子進行基因分型。表1列出的外顯子11密碼子631序列變化期望和測試的密碼子631(GAC→GAT)樣品有相同的結果:主要實驗的缺失,第二次實驗沒有基因分型的,需要測序基因型。病人和一般群體的兩個普通RET多態沒有分析,因為其沒有引起MEN2綜合癥:外顯子14p.S836S(3%至10%的等位基因頻率),外顯子11p.G691s(17%至28%等位基因頻率)。引物選擇排除外顯子11密碼子691多態,反之外顯子14多態選擇探針時排除。在一個反應中用兩個探針檢測所有的已知外顯子14密碼子836多態周圍的突變,沒有檢測多態性。密碼子836多態性的外顯子14擴增熔解曲線與一個突變有相似的Tm值及派生熔解曲線,且不能區分。因此外顯子14擴增數據不能分析,因為可以檢測密碼子836多態但是不能和突變區分,產生了不必要的測序步驟。

    在RET原癌基因內的其它報道的序列變化,引起先天性巨結腸癥(HSCR)疾病而不是MEN2,也可能是新的突變。主要實驗探針檢測的新的突變或HSCR突變不能用第二次實驗中的MEN2特定突變探針進行基因分型,需要測序。擴增熔解數據檢測到的新的突變或HSCR突變需要測序進行基因分型。這些事件非常不尋常,因為MEN2和HSCR有不同的臨床表現。雖然如此,有報道外顯子10密碼子618(TGC→CGC)和620(TGC→CGC)的突變引起MEN2和HSCR。另外,外顯子10密碼子609(TGC→AGC和TGG)和密碼子611(TGC→TCC)與HSCR有聯系,而不是MEN2。隨著RET基因分型實驗的發展,在目的外顯子的任何序列都可以基因分型,且可以根據基因型確定合適的方法。

    總的來說,RET基因分型實驗有兩步PCR,主要實驗和第二次實驗。設計主要實驗以便野生型外顯子基因分型,區分多態性(或從實驗中去除),擴增熔解數據可以檢測稀有突變,普通突變用非標記探針法或擴增熔解數據來檢測,不需要測序。第二次實驗用限制數目的特定突變探針基因分型RET突變。這兩步實驗檢測和基因分型盲實驗中所有RET野生型、突變、多態和序列變化樣品,精確度100%,用時少于測序這5個外顯子的時間的1/2。 RET基因分型實驗可用于其全部的位置或有嫌疑的RET突變,當RET突變在家族中是已知的,通過單個外顯子,或用一個特定突變探針(位置探針,如果需要的話)進行分型。

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