3.3 原代皮質神經元培養
分離原代大鼠皮質神經元細胞（Primary rat cortical neurons，PCNs），并將其接種于PEI-包被的 E-Plate
96 孔板上，每孔接種的細胞密度不同，接種密度范圍為 8000 至 32000 個細胞/孔。如圖 3A 所示，PEI
包被不會干擾細胞阻抗的測定。在添加有2% B27 的神經基礎培養基中培養 72
小時，原代神經元細胞對細胞培養的條件適應良好。xCELLigence
系統持續監測表明，可能是培養最初的幾小時內，細胞貼壁、貼附于培養孔底部，CI 值在培養初期有一定升高。不同細胞密度孔中，通過 PCNs
微管相關蛋白 2（microtubule-associated protein 2，MAP-2）染色，神經網絡的顯示非常清楚（參見圖
3B）。為去除原代培養的皮質神經元細胞中增殖的膠質細胞，于培養第 3 天，使用 1 μM CAF，對培養的細胞進行處理，共處理 48 小時。如圖
3B 所示，CAF-的處理可導致 CI 值輕微降低，極可能是去除增殖的膠質細胞的反映（參見圖 3B）。
圖 3：原代培養皮質神經元細胞的細胞濃度梯度。
（A） 特定細胞密度下的原代皮質神經元（PCNs）細胞進行培養，使用xCELLigence系統進行持續 6 天的記錄。原代分離后， PCNs 用3 天的時間適應細胞培養E-Plate 96 孔板環境。使用 CAF 處理 48 小時，以去除增殖的膠質細胞。然后繼續培養 24 小時，以便于細胞恢復。（B） xCELLigence 記錄顯示CAF-處理對 PCN 細胞的效應。在CAF添加的時間點對細胞效應進行標準化。（C） 不同細胞密度下神經元細胞 MAP-2 的染色圖片。
為監測原代培養的神經元細胞的死亡情況（16000 個細胞/孔），使用鈣離子載體或谷氨酸鹽對細胞進行處理。細胞接種后155 小時后使用鈣離子載體處理細胞，發現在添加后5 至6 小時，CI 值顯著降低（參見圖 4A）。與對照組紡錘狀扁平小體相比，暴露于鈣離子載體的原代培養細胞可見致密小體的出現（參見圖 4）。如圖 4B 所示，谷氨酸鹽處理后，48 小時至 72 小時期間 CI 值持續下降。盡管谷氨酸鹽通過 NMDA 受體的激活，可使細胞內鈣離子濃度快速增加，但與鈣離子載體處理的細胞相比，后續的細胞死亡時間顯著延遲（比較圖片 4A 與 4B）。原因可能是，與鈣離子載體處理導致的細胞膜完整性的快速喪失以及細胞壞死相比，谷氨酸鹽導致細胞死亡信號的激活會稍延遲。與以上發現一致，光學顯微鏡檢查顯示，相比與鈣離子載體處理的細胞，谷氨酸鹽處理的培養神經元細胞形態學改變的程度更小（參見圖 4C），這與 xCELLigence 系統的動態記錄結果一致。
圖 4：原代皮質神經元細胞檢測細胞死亡。
（A）于培養第 6 天使用鈣離子載體對皮質神經元細胞進行處理，使用 xCELLigence 系統繼續監測 3 天。（B）培養第 6 天時，去除生長因子，使用谷氨酸對原代皮質神經元細胞進行處理，繼續監測 6-8 天。（C）通過光學顯微鏡的觀察，記錄藥物對原代皮質神經元細胞的作用。
4 結論
細胞退化與神經細胞死亡通常與急、慢性退化性功能障礙疾病相關，如中風、帕金森癥與阿茲海默癥。對神經細胞潛在細胞死亡機制的研究是確定神經退化性疾病原因及治療措施的前提，也是研究人員的興趣所在。本研究中，我們檢測了公認的神經細胞培養模型是否可用于xCELLigence
系統，且是否可進行體外神經毒性與神經保護作用的研究。
研究發現，使用xCELLigence系統可對 HT-22
細胞與原代皮質神經元細胞的神經毒性作用進行持續監測。谷氨酸處理 HT-22
細胞后，可快速啟動神經細胞死亡，并導致其發展，因此傳統上很難確定進行終點法檢測的理想時間點。xCELLigence 通過記錄的阻抗 CI
值，實時顯示了神經毒性作用，并對何時進行下游蛋白質組學與基因組學終點檢測進行了精確定位。而且，通過進行BID抑制劑BI-6C9
在神經防護作用的實驗，進一步確定了xCELLigence系統在神經科學抑制劑研究中的適用性。更重要的是，xCELLigence
系統可使我們對整個實驗中的原代皮質神經元細胞培養條件進行監測，包括反應板接種、預培養、CAF 處理去除膠質細胞、復合物添加，以及細胞死亡圖。
總之，通過 xCELLigence系統，我們可以對神經細胞培養模型，即HT-22
細胞與原代皮質神經元細胞，其細胞培養條件進行監測。我們發現，相比于傳統的終點檢測，這種新的方法獲取的信息更多，同時可降低實驗本身及所投入的時間。而且，通過xCELLigence
系統，我們可優化進行終點分析的時間點，并深入研究神經細胞死亡的分子機制。因此，xCELLigence
系統可作為一種非常準確及方便的工具，很好地進行體外神經細胞死亡與神經保護作用研究。
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參考文獻
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來源： Sebastian Diemert, Julia Grohm, Svenja,Tobaben, Amalia Dolga, Carsten Culmsee(2010), “Real-Time Detection of Neuronal Cell Death by Impedance-Based Analysis using the xCELLigence System”, Roche Diagnostics GmbH Roche Applied Science Werk, Penzberg 82372, Germany