原位分子雜交和免疫組化SP法對PTEN的檢測
【摘要]目的：
研究原位分子雜交和免疫組化sP法檢測PTEN mRNA及其蛋白在HCC中的表述隋況。
方法：56例肝細胞肝癌組織、17例肝硬化組織手術切除標本，經40g／L福爾馬林固定，4 m厚連續切片，HE染色，病理診斷證實。
結果：HCC組織中，PTENmRNA~蛋白的陽性表達率分別為62.5％和71.4％。17例肝硬化
組織中的陽性表達率分別為88．2％和94．1％。21例癌旁組織中的陽性率分別為90.5％和100％。HCC與肝硬化組織和癌旁肝組織中PTEN mRNA及其蛋白的表達具有顯著性差異(P<005)。
結論:HCC組織中存在較高比例PTEN mRNA和蛋白表達缺失，且惡性程度最高的Hcc組織中，PTENmRNA和蛋白的陽性表達率最低。
PTEN(phosphatase and tensin homologuedeleted on chromosome ten)基因是1997年發現的一種新的腫瘤抑制基因。它在很多種腫瘤中存在著突變和缺失，與腫瘤的發生密切相關。PTEN具有脂質磷酸酶和蛋白磷酸酶雙重活性，是目前為止發現的第一個具有脂質磷酸酶活性的抑癌基因。PTEN的蛋白磷酸酶活性具有抑制細胞侵襲的作用；PTEN的脂質磷酸酶活性具有抑制細胞周期進展和誘導細胞凋亡的作用。肝細胞肝癌(hepatocellularcarcinoma，HCC)是常見的惡性腫瘤之一叫。HCC的發生是一個十分復雜和多步驟的過程，其中可能有多種抑癌基因的改變。因此，對抑癌基因的深入探討，無論對HCC發病機理的闡明，還是對HCC的預防和治疤都具有重要的意義。
1研究對象和方法
2007-2008年56例肝細胞肝癌組織、17例肝硬化組織均為湖南省腫瘤醫院病理科手術切除標本，經40g／L福爾馬林固定，4“m厚連續切片，HE染色，病理診斷證實。HCc的分級按照WHO的標準分為高分化(I級)7例，中分化(II級)28例，低分化(II級)21例。21例帶有癌旁肝組織，其中肝硬化11例，慢性活動性肝炎5例，慢性遷延性肝炎5例。原位雜交：1)切片常規脫蠟至水，3％H O封閉內源性過氧化物酶，室溫作用10min；2)蒸餾水洗3X5min。3)3％檸檬酸新鮮稀釋的胃蛋白酶，37~C消化30min，充分暴露mRNA核酸片段。4)0．5M，pH7．4的PBS緩沖液振洗3×5arin。5)滴加阻斷液，40C作用2h，以阻止非特異性的雜交。傾去，勿洗。6)滴加預雜交液，40~C作用2h。傾去，勿洗。7)滴加雜交液，42E雜交過夜。8)30～37℃水溫的2×SSC緩沖液振洗2×15min。9)滴加封閉液，37E30min。傾去，勿洗。lO)滴加抗地高辛抗體堿性磷酸酶復合物，37℃60min。11)o．5M，pH7．4的PBS緩沖液振洗4x5min。12)~o顯色液顯色，1％鹽酸酒精分化，順序酒精、二甲苯脫水透明，中性樹膠封片，以正常肝組織做陽性對照，預雜交液代替雜交液做陰性對照。免疫組織化學SP法：1)切片常規脫蠟至水，30mL·L甲醇一HO液封閉內源性過氧化物酶，室溫作用30arin。2)水沖洗，0．01M，pH7．4的PBS緩沖液浸泡10min。3)微波抗原修復：切片置于盛有0．01M，pH6．0的檸檬酸鹽緩沖液的臥式缸中，上覆有通氣孔的塑料薄膜，在高檔加熱1-2min，待修復液沸騰后，調至低檔繼續加熱8min。置于室溫，使切片自然冷卻。4)0．01M，pH7．4的PBS緩沖液振洗3×5rain。5)正常羊血清室溫封閉30min。傾去，勿洗。6)滴加1：100的兔抗PTEN多克隆抗體，4℃過夜。7)0．01M，pH7．4的PBS緩沖液振洗3x5min。8)滴加生物素標記的羊抗兔IgG，37℃作用標記的鏈酶卵白素，37℃作用30min。11)o．01M，pH7．4的PBS緩沖液振洗3x5min。12)DAB顯色，蘇木素復染，l％鹽酸酒精分化，順序酒精、二甲苯脫水透明，中性樹膠封片，光鏡下觀察。以正常肝組織
做陽性對照，0．01M，pH7．4的PBS代替一抗做陰性對照。結果判定及統計學分析：凡胞質中出現明顯的淡藍色顆粒(原位分子雜交)、棕黃色顆粒(免疫組織化為PTEN陽性細胞。在肝組織中，根據陽性細胞與全部細胞的比例分為：陰性：無陽性瘤細胞，陽性(+)：陽性細胞／J、于25％陽性(++)：陽性細胞占25％～5O％l陽性(+++)：陽性細胞大于5&／o。統計學分析用Sf 10．O統計學軟件進行統計分析。兩樣本構成比采用檢驗。統計學顯著陛差~gNP<O．05。
2結果
2．1原位雜交PTEN
mRNA定位于胞質，陽性反應產物呈淡藍色顆粒，PTEN mRNA陽性細胞呈彌漫性分布。3例正常肝組織中PTEN mRNA的表達均為陽性；17例肝硬化組織中，PTENmRNA表達陽性率為88．2％(15／17)，見圖1；21例癌旁肝組織中，PTEN mRNA陽性表達3,g~j90．5％(19／21)，見圖2；而56例HCC組織中PTEN mRNA表達的陽性率為62．5％(35／56)，見圖3。PTENmRNA在癌旁肝組織及肝硬化組織中的表達明顯高于HCC組織(P<0．05，表1)。56例HCC組織中，I和II級PTEN mRNA表達明顯高于Ⅲ級(P<O．05，表2)，而在I與II級之間，則無明顯差異。
2．2免疫組織化學結果
PTEN蛋白主要定位于胞質，陽性反應產物呈棕色或棕黃色顆粒，彌漫性分布。3例正常肝組織中PTEN蛋白的表達均為強陽性(+++)；肝硬化組織中PTEN蛋白表達陽性率為94．1％(16／17)，主要為強陽性表達；21例癌旁肝組織均為強陽性表達：而56例HCC組織中PTEN蛋白表達的陽性率為71．4％(40／56)(表3)，免疫反應強弱不等，一些標本中，陽性信號較弱。癌旁組織與肝硬化組織中，PTEN的陽性表達率明顯高于HCC組織(P<0．O1)。在6例HCC組織中，I、II級PTEN蛋白表達陽性率明顯高于III級(尸<0．05，表4)，而在I與II級之間，則無明顯差異。另#hi、II級PTEN蛋白的陽性表達強度明顯高于III級，多為++～+++，而III級組織中，PTEN染色多為弱陽性或陰性表達。
3討論
本研究應用原位雜交技術和免疫組織化學技術，對56例HeC組織和17例肝硬化組織及3例正常的肝組織進行了PTENmRNA和PTEN蛋白的檢測。在所有3例正常肝組織中，PTEN mRNA和PTEN蛋白均呈陽性表達。在17例肝硬化組織中，PTEN mRNA和PTEN蛋白表達均呈不同強度的陽性表達，陽性率分別為88．2％(15／17)和94．1％(16／l7)。56例HCC組織中，PTEN mRNA和PTEN蛋白的陽性表達率分別為62．5％和71．4‰而2l例癌旁組織中，PTEN mRNA和PTEN蛋白的陽性表達率分別為90．5％(19／21)30min。9)0．01M，pH7．4的PBS緩沖液振洗3X5arin。10)滴加辣根酶和100％。統計學分析表明，PTEN mRNA和PTEN蛋白在癌旁和肝硬化組織中的表達與其在HCC組織中的表達具有顯著性差異(P<0．05)。這表明，PTENmRNA和PTEN蛋白在HCC的發生發展中存在著缺失，提示其有可能在HCC的發生發展過程中起到一定的作用。到目前為止，關于PTEN基因在HCC組織和細胞中的研究也只是局限于對基因突變和缺失的研究，對于PTENmRNA及其蛋白在肝癌組織中的表達情況，卻很少有報道。本文的研究結果表明，PTEN在mRNA和蛋白水平的表達缺失在惡性程度高的HCC組織中存在著相當高的比例，有可能~_PTEN基因在HCC中失活的主要方式之一。因此，深刻闡明PTEN基因在人體正常組織中的作用及其作用機制，對明確肝細胞肝癌的發病機制，采取相應有效的基因治療方法具有重大的意義。
4結論
PTEN mRNA及其蛋白都主要定位于胞質中。它們在癌旁組織和肝硬化組織中的表達都明顯高于HCC組織<0．o5)。HCC組織中PTENmRNA及其蛋白的表達與HHCC的分化程度呈正相關。HCC的分化程度越高，PTEN mRNA及其蛋白的表達率越高。提示，PTEN基因在肝癌的發生發展中可能起到一定的作用。
（當代醫學 王勁）