(張蓓，沈立松 上海第二醫科大學附屬新華醫院上海兒童醫學中心實驗診斷中心)
摘要:多聚酶鏈反應飛速的發展使其成為了分子生物學實驗室重要的工具，實時熒光定量PCR(real-timequantitative PCR)技術以其敏感性高、重復性好、速度快和污染少使PCR技術又向前邁進了一步。本文對real-timeQ-PCR技術的原理、五種主要的熒光化學及定量方法作一介紹，同時也討論了此技術存在的不足，并對其目前在研究領城中主要的應用進行了概述。
多聚酶鏈反應(polymerasechainreaction,PCR)技術發明至今已近20年了，在這期間其技術得到了不斷的發展，近年來出現的實時熒光定量PCR(real-timequantitativePCR)技術實現了PCR從定性到定量的飛躍，它以其特異性強、靈敏度高、重復性好、定量準確、速度快、全封閉反應等優點成為了分子生物學研究中的重要工具，本文就此技術及其應用做一綜述。
1實時熒光定量PCR技術的方法學
1.1原理
所謂real-timeQ-PCR技術，是指在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號累積實時監測整個PCR進
程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。在real-time技術的發展過程中，兩個重要的發現起著關鍵的作用:(1)在90年代早期，TaqDNA多聚酶的5'核酸外切酶活性的發現，它能降解特異性熒光標記探針，因此使得間接的檢測PCR產物成為可能。(2)此后熒光雙標記探針的運用使在一密閉的反應管中能實時地監測反應全過程。這兩個發現的結合以及相應的儀器和試劑的商品化發展導致real-time令PCR方法在研究工作中的運用。
PCR反應過程中產生的DNA拷貝數是呈指數方式增加的，隨著反應循環數的增加，最終PCR反應不再以指數方式生成模板，從而進入平臺期。在傳統的PCR中，常用凝膠電泳分離并用熒光染色來檢測PCR反應的最終擴增產物，因此用此終點法對PCR產物定量存在不可靠之處。在real-timeQ-PCR中，對整個PCR反應擴增過程進行了實時的監測和連續地分析擴增相關的熒光信號，隨著反應時間的進行，監測到的熒光信號的變化可以繪制成一條曲線。在PCR反應早期，產生熒光的水平不能與背景明顯地區別，而后熒光的產生進入指數期、線性期和最終的平臺期，因此可以在PCR反應處于指數期的某一點上來檢測PCR產物的量，并且由此來推斷模板最初的含量。為了便于對所檢測樣本進行比較，在real-timeQ-PCR反應的指數期，首先需設定一個熒光信號的域值，一般這個域值(threshold)是以PCR反應的前15個循環的熒光信號作為熒光本底信號(baseline),熒光域值的缺省設置是3-15個循環的熒光信號的標準偏差的10倍。如果檢測到的熒光信號超過域值被認為是真正的信號，它可用于定義樣本的域值循環數(CO.Ct值的含義是:每個反應管內的熒光信號達到設定的域值時所經歷的循環數。研究表明，每個模板的Ct值與該模板的起始拷貝數的對數存在線性關系，起始拷貝數越多，Ct值越小。利用已知起始拷貝數的標準品可作出標準曲線，因此只要獲得未知樣品的Ct值，即可從標準曲線上計算出該樣品的起始拷貝數。
1.2熒光化學
目前real-timeQ-PCR所使用的熒光化學方法主要有五種，分別是:DNA結合染色，水解探針，分子信標，熒光標記引物，雜交探針。它們又可分為擴增序列特異和非特異的檢測兩大類。
擴增序列非特異性檢測方法的基礎是DNA結合的熒光分子，如SYBRgreen1[33等熒光染料。Real-timeQ-PCR發展早期就是運用這種最簡單的方法，在PCR反應體系中，加入過量SYBRgreen1熒光染料，SYBRgreen1熒光染料特異性地摻入DNA雙鏈后，發射熒光信號。熒光染料的優勢在于它能監測任何dsDNA序列的擴增，不需要探針的設計，使檢測方法變得簡便，同時也降低了檢測的成本。然而正是由于熒光染料能和任何dsDNA結合，因此它也能與非特異的dsDNA(如引物二聚體)結合，使實驗容易產生假陽性信號。引物二聚體的問題目前可以用帶有熔解曲線(meltingcurve)分析的軟件加以解決。
擴增序列特異性檢測方法是在PCR反應中利用標記熒光染料的墓因特異寡核普酸探針來檢測產物，它又可分為直接法和間接法。間接的方法就是利用水解探針的策略川。目前在real-timeQ-PCR中最廣泛使用的TagMan系統就是運用了這個原理。PCR擴增時在加入一對引物的同時加入一個特異性的熒光探針，該探針為一寡核普酸，兩端分別標記一個報告熒光基團和一個淬滅熒光基團，此時5，端熒光墓團吸收能量后將能量轉移給臨近的3’端熒光淬滅墓團(發生熒光共振能量轉移，FRET)，因此探針完整時，檢測不到該探針5'端熒光墓團發出的熒光。但在PCR擴增中，溶液中的模板變性后低溫退火時，引物與探針同時與模板結合。在引物的介導下，沿摸板向前延伸至探針結合處，發生鏈的置換，Taq酶的5'-3'外切酶活性(此活性是雙鏈特異性的，游離的單鏈探針不受影響)將探針5'端連接的熒光基團從探針上切割下來，游離于反應體系中，從而脫離3，端熒光淬滅基團的屏蔽，接受光刺激發出熒光信號，即每擴增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，實現了熒光信號的累積與PCR產物形成完全同步。
直接的方法指的是標記熒光的探針與擴增產物結合后即直接產生熒光。分子信標(molecularbeacon)['〕就屬于這一類，它本質上是一種標記熒光的發夾探針，當探針分子呈發夾結構時，結合在其兩端的熒光基團距離上接近，使得產生能量轉移效應，而不發生熒光。當互補序列出現時，探針與DNA雜交，探針轉變成一個開放的結構，呈線性，報告熒光基團與淬滅熒光墓團彼此在空間上產生足夠的分離，熒光基團脫離了淬滅墓團的影響，從而產生可被檢測到的熒光。熒光標記引物是從分子信標的概念變化而產生的一種聯合分子探針系統，它把熒光基團標記的發夾結構的序列直接與PCR引物相結合，從而使熒光標記基團直接摻入PCR擴增產物中。目前主要有兩種:日出引物(sunriseprimes)和蝎子引物(scorpionprimes)。雜交探針(hybridizationprobe)使用兩個特異的探針，其中上游的探針的3'端標記有供體熒光素(donor)，而下游的探針的5‘端標記有受體熒光素(acceptor)。在PCR中模板退火階段，兩探針同時與擴增產物雜交，并形成頭尾結合的形式，使供體和受體熒光素距離非常接近，兩者產生熒光共振能f轉移(FRET，此作用與上述水解探針的方式相反)，使得受體熒光墓團發出熒光;當兩探針處于游離狀態時，無熒光產生。由于反應中運用了兩個探針，因此增加了方法的特異性，另外也可利用熒光寡核普酸熔解曲線(meltingcurve)對與寡核普酸探針結合的序列進行分析，從中獲取有用的信息。